苏大分子生物学第九章

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第九章 第一节 第二节 第三节

目的基因的分离和克隆 目的基因的分离和克隆目的基因的获得 获得目的基因方法的选择 目的基因重组体的构建

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第一节

目的基因的获得

一、化学合成 二、聚合酶链反应(PCR) 方法扩增目 的基因 三、建立基因组DNA文库 四、构建cDNA文库筛选目的基因 五、其他方法

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一、化学合成法

自动化 DNA合成仪

1.要求 要求：1)已知目的基因的核苷酸序列或其对 要求 应的多肽链氨基酸序列 2)较短的DNA片段，有专一性和定 向性 2.原理 原理：第一个核苷酸固定于不溶性的固相载 原理 体上, 然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3’、 5’-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应(封 闭非反应基团 ),其后用洗涤法除去多余的反 应物和副产物, 再用同样的步骤与下一个核苷 酸进行缩合反应, 如此循环将合成的寡核苷酸 链从载体上洗脱下来, 解除保护基, 进一步纯化。

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应用范围：1)合成PCR引物 2)寡核苷酸探针 3)人工接头及较小的基因

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二、建立基因组DNA文库基因组文库：分离真核生物中某种DNA成分, 基因组文库 通常是分离供体细胞中的染色体DNA,酶 切后，将这些染色体DNA片段与某种载体 相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真 核细胞染色体DNA片断的克隆株, 这种克 DNA , 隆株群体。 1.特点：提供全套遗传信息, 即完整的基因组 DNA,可以研究基因组中5’端控制基因转录 的调控序列, 内含子的分布和作用, 以及重 复序列的数量分布及大小

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2.构建基因组文库全过程(DNA重组的过程 ) ⑴ 分离纯化基因组DNA, 提取哺乳动物细胞染色体DNA ⑵制备全部基因组的DNA片断 ①机械断裂 法 用超声波或高速搅拌DNA溶液 断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端, 因此插入 载体之前还需要进行修饰加工，少用 ②限制性内切酶降解(鸟枪法) 过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A 断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与 处理过的载体连接。

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⑶ DNA片断与载体的连接包装 常用载体：粘性质粒 λ噬菌体 酵母人工染色体 ①基因组DNA +粘性质粒——重组DNA— —转化细菌 菌落 ②基因组DNA + λ噬菌体 ——重组DNA— 包装成噬菌体——感染细菌 噬菌斑 1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆 群体就包含基因组的全部基因片段总和。

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基因组文库大小的计算1975年L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重 组体所需实际克隆数( N )的公式： In(1-P) N = ——————— In (1-f) P为在基因组文库目的基因出现的几率(一般为99%);f为 插入的限制片断长度/整个基因组DNA

总长度。 例如：从人基因组DNA(总长度为3×109bp)的文库中筛选 到长约1.5kb目的基因的可能性为99%,那么这个基因组文 库要多大？ In(1-0.99) N = ——————————————— = 9.2×106 In (1-1.5×100/3×106)

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若用质粒(pBR322)克隆目的基因(1.5kb) 需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA 序列;若 用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因 的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重 组体克隆数可以减少到9×105, 而要用柯斯质粒 将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降 到3.5×105左右,均可满足建库要求。表4-1 三种常用基因组文库克隆载体的比较 载体种类 装载量 转 染 率

λ噬菌体 粘性质粒 (Cosmid) 酵母人工染色体 (YAC)

9~22kb 30~45kb 100~1000kb

105~106转化子/µgDNA 104~106转化子/µgDNA ~500转化子/µgDNA

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四、构建cDNA文库cDNA文库：以mRNA为模板在反转录酶的 作用下将形成的互补DNA(cDNA )建 立基因文库(gene library)。

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特点： 1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操 作更为方便。 2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。 3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。(转录特征) 4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同 6. 不能研究基因组的结构功能

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构建cDNA文库 1.制备 制备mRNA 1.制备mRNA 1)取材：mRNA约占总RNA的1-5%,所以应选 用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材 料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞 为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原 或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料 2)从总的RNA中分离mRNA 将提取的mRNA在寡聚脱氧胸苷酸[ oligo(dT) ] 纤 维素中进行亲和层析

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2.第一股 cDNA合成 2.第一股 cDNA合成 1)以Oligo(dT) 为引物：从模板3’末端开始，沿模板 的3’→5’方向合成, 对于较长的mRNA分子很难得到 全长cDNA 2)随机引物：以6~8个核苷酸为随机引物，从mRNA 的不同结合点合成全长cDNA第一链(RNA-DNA) 3.第二股cDNA的合成 第二股cDNA 3.第二股cDNA的合成 ⑴ 自身引导法： ⑵ 置换合成法 ⑶ 外加引物合成法 4.cDNA与载体连接和导入宿主细胞 4.cDNA与载体连接和导入宿主细胞

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筛选目的基因 ⑴ 核酸杂交法 特殊标记的寡核苷酸链为探 针 将扩增好的cDNA文库(即许多带有cDNA重 组体大肠杆菌培养皿内所形成的菌落或噬 菌斑)转印到硝酸纤维素膜上，碱解后加 带标记的探针进行杂交，能显示特异结合 探针的点(克隆)便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取， 再用限制性酶切出cDNA基因片断，即为目 的基因。(如图)

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⑵ 免疫结合法 噬菌斑转印到硝酸纤维膜上，各种cDNA 表达并呈现在噬菌体表面的蛋白质便牢 固地结合在膜上。然后将膜放入含有特 异抗体的溶液中进行免疫结合反应，洗 去未结合的抗体后，再与125 I 标记的第二 抗体结合, 从而找出带有放射性示踪信号 的斑点, 进而找出对应噬菌斑, 克隆扩增, 提取DNA后经酶切可获目的基因。