植物组织培养校本教材123 - 图文(7)

镊子、剪刀等接种工具在每次使用之前，均应在酒精灯火焰上反复灼烧，但应放凉后再接种，以防烫伤外植体。也可先放入70％酒精中浸泡，再在酒精灯火焰上灼烧。

外植体接种的具体操作如下：左手持培养容器（三角瓶、试管、果酱瓶等），右手轻轻取下封口纸或拧开瓶盖，将容器口靠近酒精灯火焰，瓶口略倾斜，以防空气中微生物落入瓶中造成污染，将容器口外部在火焰上灼烧数秒，以将灰尘杂质等固定在瓶口处。用灭过菌的镊子夹取切割好的外植体送入容器中并臵于培养基上，这一过程要轻缓，并避免外植体材料碰到容器口和容器壁。

外植体在培养容器内要分布均匀，一方面保证培养基养分供应均匀，同时也保证出芽后小植株不会相互遮光。茎尖、茎段等外植体基部应插入培养基，但不宜过深，不能使芽陷入培养基中。叶片一般将叶背接触培养基，因为中背气孔较多，更容易吸收水分和养分。

接种后，应及时封口或拧好瓶盖，以防空气中微生物落入瓶中。所有材料接好后，应做好标记，注明植物品种或品种代号、处理名称、接种日期及接种人，然后统一放入培养室培养。

3.5 材料的培养

3.5.1 培养方法

1）固体培养 固体培养是用琼脂固化的培养基来培养植物材料的方法。这是现在最常用的方法。该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐变中毒现象发生。

2) 液体培养 液体培养是用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。如细胞悬浮培养、原生质体培养等。液体培养需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，常采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。 3.5.2 培养条件

接种后的外植体应转移到培养室进行培养，培养条件要根据植物对环境条件的不同需求进行调控。培养室控制的条件主要有温度、光照、湿度和气体。 1）温度

温度是植物组织培养中的重要因素，在适宜的温度下植物才能良好地生长、分化。多数植物适宜生长温度为20-30℃，低于15℃时生长停止，高

21

于35℃时会抑制正常生长和发育。 2）光照

光是植物进行光合作用必不可少的条件之一，对离体培养物的生长发育具有重要的作用。光照的影响主要表现在光照强度、光照时间和光质三个方面：

（1）光照强度 对大多数植物来说，1000-4000lx的光强就能满足其生长的需要。器官的分化需要光照，并随着试管苗的生长光照强度需要不断的加强，才能使小苗生长健壮，并促进它从“异养”向“自养”转化，以提高移栽后的成活率。而对愈伤组织的诱导来说，暗培养比光培养更合适，所以在前期可以适当的对光照进行控制，以提高分化生长。

（2）光照时间 普通培养室要求每日光照12-16h，生产中，在不影响材料正常生长的情况下，尽量缩短光照时间，以减少能源消耗，降低生产成本。

（3）光质 光质对细胞分裂和器官分化有很大的影响，但目前尚无规律可循，可根据植物在生长中的具体现象加以调整和改善，以达到节约能源，提高产量的目的。 3）湿度

组织培养中湿度的影响主要有培养容器内湿度和培养环境湿度两方面。 （1）培养容器内湿度 容器内湿度通常可保持在100%，之后随着时间的推移，相对湿度也会相应下降，容器内的湿度主要受琼脂含量和封口材料的影响，在冬季应适当减少琼脂用量，否则培养基干硬，不利于外植体接触或插进培养基中，导致生长发育受阻。

（2）培养室环境的湿度 环境湿度变化随季节和大气而有很大的变动。湿度过高或过低对植物材料的生长都不利，过低会造成培养基失水干枯，影响培养物的分化合生在；过高会造成杂菌滋生，导致污染。通常培养室的湿度要保持在70%-80%。 4）气体环境

植物组织培养中，植物的呼吸需要氧气。在液体培养基中，需进行振荡和旋转以解决氧气供应。在固体培养基中，接种时不要把培养物全部埋入培养基中，以避免氧气不足。另外切割外植体后产生的乙烯和培养物产生的二氧化碳也会阻碍培养物的生长和分化。因此培养室要定期进行通风换

22

气，每次通风后要进行消毒以防止污染。 3.5.3 初代培养

初代培养是指接种外植体后最初的几代培养，其目的是获得无菌此材料和无性繁殖系。初代培养建立的无性繁殖系包括茎梢、芽丛、胚状体和原球茎等。

1）培养基的选择

初代培养基时常采用诱导或分化培养基，培养基中的生长素和细胞分裂素的配比和浓度最为重要，诱导不定芽时需要较高的细胞分裂素；诱导愈伤组织形成时，增加生长素的浓度并补充一定的细胞分裂素是十分必要的。

2）外植体的生长和分化 （1）顶芽和腋芽发育

这种发育方式的特点是不经过逾伤组织阶段而直接再生繁殖。发育方式：

茎尖、侧芽、节等外植体→直接再生丛生芽→幼茎→生根→小植株 （2）不定芽发育：经过逾伤组织阶段诱导产生小植株

由不定芽产生的组织培养苗，比直接从顶芽或腋芽中产生的丛生芽苗，具有更大的性状变异几率。发育方式：

根、茎、叶等外植体→逾伤组织→生长点→幼茎→生根→小植株 （3）胚状体发育：由植物的体细胞，经过诱导产生的体细胞胚，其功能类似合子胚，但与合子胚不同。优点是成苗数量多，速度快，结构完整。

（4） 原球茎发育：由茎尖或侧芽的培养中产生原球茎并增殖、萌发出小植株。石斛属的植物是常见的原球茎发育植物，其种子、茎段、茎尖、叶片、幼根都可以作为外植体诱导原球茎产生，但外植体的选取部位对诱导会产生一定的影响，如铁皮石斛，基部茎段的增殖系数比上部茎段的增殖系数高，生长速度快。 3.5.4 继代培养

3.5.4.1 继代培养的目的

植物在培养过程中，如长期在同一培养基上培养，会出现以下情况： 1）培养基中成分不断被消耗，无法满足继续生长的需要； 2）试管苗生长旺盛，容器大小开始限制植物生长；

23

3）培养过程中植物材料所分泌的有毒有害物质，积累过多对植物组织产生伤害。

4）长期不转接会产生污染。

因此，当容器中植物材料持续培养一段时间后，必须转接进行继代培养。继代培养又称增殖培养是指愈伤组织在培养基上生长一段时间后，营养物枯竭，水分散失，并已经积累了一些代谢产物，此时需要将这些组织转移到新的培养基上。继代培养可采用无菌苗进行继代，也可利用逾伤组织进行继代培养。 3.5.3.2 继代培养的方法

继代培养是继初代培养之后的连续数代的扩繁殖培养过程。旨在繁殖出相当数量的无根苗，最后能达到边繁殖边生根的目的。继代培养的后代是按几何级数增加的过程。如果以2株苗为基础，那么经10代将生成210株苗。

继代培养中扩繁的方法包括：切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。

1）切割茎段常用于有伸长的茎梢、茎节较明显的培养物。这种方法简便易行，能保持母种特性。培养基常是MS基本培养基；

2）分离芽丛适于由愈伤组织生出的芽丛。培养基常是分化培养基。若芽丛的芽较小。可先切成芽丛小块，放入MS培养基中，待到稍大时，再分离开来继续培养。

3）分离原球茎将原球茎切割成小块，也可以给予针刺等损伤，或在液体培养基中振荡培养，来加快其增殖进程。

4）胚状体增殖

增殖使用的培养基对于一种植物来说每次几乎完全相同，由于培养物在接近最良好的环境条件，营养供应和激素调控下，排 …… 此处隐藏：2772字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……