第四章_沉淀分离法

固相析出分离技术1.概念： 通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以 固体形式从溶液中沉淀析出的分离纯化技术。

2.种类结晶法：析出物为晶体 沉淀法：析出物为无定形固体

3.沉淀和结晶(晶体)的异同点 相同：在本质上同属一种过程(固相析出)

区别：构成单位(原子、离子或 分子)的排列方式不同 晶体：有规则

无定形沉淀：无规则

条件缓慢变化时，溶质分子有足够时间排列， 有利于结晶形成； 条件变化剧烈，强迫快速析出，溶质分子来不 及排列就析出，形成无定形沉淀。分 离 效 果

结晶法：高度的选择性(原因：只有同类分子 或离子才能排列成晶体)。 沉淀法：浓缩与分离，但所得的沉淀物聚集多 种物质，或含有盐类，或包裹着溶剂。

第四章 沉淀分离法

沉淀法： 利用某种沉淀剂或改变条件，使所需提取 的物质或杂质在溶液中的溶解度降低而形成 无定形固体沉淀的过程。

具有浓缩和分离的双重作用。在蛋白质、酶、多肽、核酸和其他细胞组 分的回收和分离中应用的很多。

盐析沉淀法 有机溶剂沉淀 等电点沉淀法

成盐沉淀法高分子聚合物沉淀

选择性变性沉淀法

一、盐析沉淀法盐析法：在高浓度中性盐存在下，欲分离物质在中性 盐水溶液中的溶解度降低而产生沉淀。 早在19世纪盐析法就被用于从血液中分离蛋 白质，目前该方法仍广泛用来回收或分离蛋白 质(酶)等生物大分子物质。

(一)基本原理蛋白质的溶解特性取决于其组成、构象、周 围环境的物理化学性质以及溶剂的可利用度。 这些性质就本质而言是水分子间的氢键和蛋白 质表面所暴露出的N、O原子的相互作用，所以 易受溶液温度、pH值、介电常数和离子强度等 参数的影响。

蛋白质在自然环境中通常是可溶的， 表面：大部分是亲水基团 内部：大部分是疏水基团两性物质，一定pH下表面带有一定的 电荷，静电斥力作用使分子间相互排斥 蛋白质周围的水分子有序排列，在表面 形成水化膜，这一层能保护蛋白质粒子 避免因碰撞而聚沉。

蛋白质呈稳定 的分散状态

当向蛋白质溶液中加入中性盐时：低盐--盐溶(低盐情况下，随着中性盐离子强度的 增加，蛋白质溶解度增大)

高盐--盐析(高盐浓度时，蛋白质溶解度随之减小)

盐离子部分中和蛋白 质的电性，使分子间 排斥作用减弱

中性盐的亲水性比蛋白质大， 盐离子在水中发生水化作用 从而使蛋白质脱去水化膜， 暴露出疏水区域

_+ +_ H+ + + ++ _ + + +_ ++ + OH_ + ++ +pH<pI,带正电， 有水膜，是稳定 的亲水胶体 中性盐 破坏水膜 pH=pI时, 有水膜， 是不稳定的亲水 胶体 中性盐 破坏

水膜

_ _ _ _ _ _ _ _ _pH>pI,带负电， 有水膜，是稳定 的亲水胶体 中性盐 破坏水膜 中性盐 中和电荷 NH4+ 或Na+

中性盐 ++ + + + 中和电荷 _ + + _ _ + ++ + SO42- +_ _ + ++ + 蛋白质沉淀

_ _ _ _ _ _ _ _ _

蛋白质的盐析机制示意图

蛋白质在水中的溶解度不仅与中性盐离子的浓 度有关，还与离子所带电荷数有关，高价离子影 响更显著。 通常用离子强度表示对盐析的影响。

2.5 蛋白质溶解度 2.0 1.5 lgS 1.0 0.5 0 起始蛋白 -0.5 浓度 -1.0 -1.5

β S0 盐溶

碳氧血红蛋白的lgS 与(NH4)2SO4离子强 度μ的关系

盐析

1 2 3 4 5 6 μ(离子强度)

盐析区: lgS = β - Ks μ蛋白质溶解度 常数 盐析常数 盐离子强度

(二)无机盐的选择在蛋白质盐析中，常用的盐析剂有(NH4)2SO4,Na2SO4, MgSO4,NaH2PO4,NaCl, Na3PO4, K3PO4。

廉价(NH4)2SO4 原因

在水中溶解度大，且溶解度随温度变 化小，低温下仍具有较大的溶解度 对大多数蛋白质的活力无损害

常用盐析剂在水中的溶解度(g/100ml水)中性盐 0 (NH4)2SO4 Na2SO4 20 70.6 75.4 4.9 -1.6 18.9 34.5 7.8 温度(oC) 40 60 80 100 103 42.2 70.8 101

81.0 88.0 95.3 48.3 45.3 43.3 44.4 54.6 63.6 54.1 82.6 93.8

MgSO4NaH2PO4

盐析效果：阴离子 > 阳离子尤其以高价阴离子更为明显。 常见阴离子的盐析作用顺序：PO43- > SO42- > CH3COO > Cl > NO3 > ClO4 > I > SCN

阳离子对盐析效果的影响：Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+

无机盐可按两种方式加入溶液中： 直接加入固体(NH4)2SO4粉末—工业生产(分批加入，充分搅拌)

加入(NH4)2SO4饱和溶液—实验室和小规模生产(防止溶液局部过浓，但加量较多时溶液会被稀释)