5湖南省2010年度人感染高致病性禽流感监测实施方案(9)

3）观察结果并用凝胶成像系统拍照记录。 （四）结果判断

在系统成立，即阴阳性参考均正常的条件下，判断结果，阳性各条带为：甲型（210bp）出现特异性条带，判为阳性结果。未出现条带，或不在上述位置出现非特异性条带，均判为阴性结果。

四、A型流感病毒实时荧光定量PCR检测

实时荧光定量（Real-time）RT-PCR技术，是指在RT-PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。如下是几个在结果判断中涉及到的几个概念：

图1：Real-Time RT-PCR反应标准曲线

1．阈值（threshold）：PCR反应前15个循环荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的缺省设置是6～15个循环荧光信号标准偏差的10倍。

2．基线（baseline）：指PCR反应指数扩增前平均本底荧光信号值，通常取6～15个循环的平均荧光信号值。

3．Ct值：C代表Cycle，t代表threshold。Ct值是指反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数。

4．Ct值与起始模板的关系：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，

只要获得未知样品的Ct值，可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

（一）生物安全要求

分装标本、裂解病毒需在BSL-2级实验室生物安全柜操作。核酸检测区域要分出试剂配制、核酸提取、扩增、检测的不同分区。

（二）主要材料

1．核酸提取Kit：QIAGEN公司 RNeasy Mini Kit， Cat No.74104。 2．Real-time RT-RTPCR Kit：QIAGEN公司 QuantiTectTM Probe RT-PCR Kit， Cat No. 204443。

3．引物及探针：包括甲型通用引物及探针序列如下。

类型 FluA-Forward 甲型 FluA-Reverse FluA-probe （三）实验步骤

1．病毒核酸提取：同RT-PCR。 2．Real-time RT-PCR反应： （1）实验设计 1）检测标本

2）质控参数：阴性对照（核酸提取时，同标本同时提取无菌水） 阳性对照（已知病毒核酸） （2）反应体系的配制：

1）准备工作：进入BSL-2 PCR反应体系配制区，将QuantiTectTM Probe RT-PCR Kit、引物及探针拿出置室温直至溶解。

2）按照下列试剂及每个反应所需体积计算总反应数后，按照总反应数+1的量进行配制。

组 分

QuantiTect Probe RT-PCR Master Mix 上游引物（40μM） 下游引物（40μM）

体 积 （μL）

12.5 0.5 0.5

序列 5’-GAC CRA TCC TGT CAC CTC TGA C-3’ 5’-GGG CAT TYT GGA CAA AKC GTC TAC G-3’ 5’-TGC AGT CCT CGC TCA CTG GGC ACG-3’ Probe （10 μM） QuantiTect RT Mix RNase Free H2O Total

0.5 0.25 5.75 20

（3）反应液分管：以20μL/管将反应液依次分装至0.2mLPCR管中，并做好标记。

（4）将上述加有反应液的PCR管拿至核酸提取区，以5μL/管依次加入阴性对照、待检标本和阳性对照反应模板RNA。

（5）将加好上述反应体系的PCR管拿至核酸扩增区工作间，先后打开荧光定量PCR仪和联机电脑，将PCR管放于荧光定量PCR仪上进行扩增反应，在联机电脑中输入以下反应程序并运行程序：

1）60℃作用5min， 2）50℃作用30min， 3）95℃作用15min， 4）95℃变性15s， 5）55℃退火30s， 6）72℃延伸30s， 回到第4步，45个循环 7）72℃作用5min

（6）结果观察：在质控标准有效的情况下进行结果判断。 1）Ct值无数值的样本为阴性样本。 2）Ct值≤30.0的样本为阳性。

3）Ct值大于30.0的样本建议重做。重做结果无数值者为阴性，否则为阳性。如检测结果在可疑范围内可参考其他检测结果。检测体系有已知检测极限的阳性对照和标准品作为灵敏度指示，Ct值在检测极限内可以判断为阳性。

（7）质控标准

1）阴性对照的检测结果为阴性。 2）阳性对照的Ct值应为阳性。 3）否则，此次实验视为无效。

附录3、湖南省流感监测网络实验室编号规则

实验室编号 53 54 国家统一编号 55 56 57 4303 4304 4305 4306 4308 本省临时编号 4309 4311 4312 4313 4331 益阳市疾病预防控制中心 永州市疾病预防控制中心 怀化市疾病预防控制中心 娄底市疾病预防控制中心 湘西自治州疾病预防控制中心 网络实验室所在单位 湖南省疾病预防控制中心 郴州市疾病预防控制中心 长沙市疾病预防控制中心 株洲市疾病预防控制中心 常德市疾病预防控制中心 湘潭市疾病预防控制中心 衡阳市疾病预防控制中心 邵阳市疾病预防控制中心 岳阳市疾病预防控制中心 张家界市疾病预防控制中心