5湖南省2010年度人感染高致病性禽流感监测实施方案(7)

使用PH7.2 的PBS同时加入1‰NaN3以防止细菌生长。煮沸或者用微波炉使1%琼脂糖完全溶解，速置60℃水浴箱中，分装于小烧杯中，2.9mL/杯，置60℃水浴箱中。根据工作量计算出所需烧杯的数量。

3．红细胞处理

按每块扩散板需50μl 浓的鸡红细胞，计算出工作中所需的浓红细胞容量，将所需的浓鸡红细胞放入带尖底的15mL离心管中，加入等容量的5×10-4 mol/L KIO4，混匀，置室温15min。 KIO4处理的目的是使病毒吸附到红细胞表面后不会游离下来。

4．加病毒抗原

按每0.1mL 浓鸡红细胞需1000个红细胞凝集单位病毒抗原的比例，加入KIO4处理过的红细胞，混之，置室温10min，1500rpm离心3min，弃上清，用至少5倍量于沉淀物的pH7.2 PBS冲洗，1500rpm离心10min，弃上清，加入与红细胞等量的pH7.2 的PBS。

5．把所需的扩散板平排好，并标明标记。 6．溶血板制备

用吸管将步骤中红细胞轻轻吹匀，而后吸出100μL放入恒温在60℃水浴箱中含2.9mL琼脂糖的烧杯，置水浴中摇匀，而后迅速倒入扩散板中，并迅速用烧杯铺平之。待第一块板铺完后，按同法铺第二块板，直至全铺完。溶血板凝固后应为红细胞均匀分布的透明凝胶板，若出现芝麻样颗粒、浓淡不均的血丝等，均应重新进行铺板。

7．打孔

待琼脂糖完全凝固（一般置室温15~20min）后打孔，诊断用打3mm直径孔，血清流行病学调查打2mm直径孔。打完后用针头将孔中琼脂挑出，然后盖上板盖。

8．加样

孔径3mm的一般10μL/孔，孔径2mm的为4~5μL/孔，每批实验必须要有阳性和阴性血清对照；配对血清应在同一板上进行，以便减少板间的误差。

9．扩散

当每块板加完样本，马上盖上板盖。待全部板加完样本并盖上板盖，平放在

带有湿度的盒子中，置4℃冰箱扩散16～18h。

10．加补体

补体从-70℃冰箱取出，用自来水龙头冲之，让其速溶。溶后速置冰上，用冷的pH 7.2 PBS进行1:3或1:4稀释，即1mL补体稀释成3mL或4mL。将扩散板从冰箱取出，平放实验桌上，每板平铺稀释好的补体1mL，平放带有湿度的盒中，无需板盖，平放35~37℃ 孵箱4h。正常红细胞对照板，除病毒用pH7.2 PBS替代外，其余操作步骤完全与实验板相同。

11．结果观察和判断

4 h以后，从孵箱中取出，倒掉补体，进行结果观察。

（1）阳性对照血清应出现清晰，而不是模糊或不透明的溶血圈，并溶血圈面积比预实验的不能相差1.5倍或以上；阴性对照血清不应出现任何溶血圈。

（2）正常红细胞对照板不应出现任何溶血圈。

（3）恢复期血清溶血圈面积应为急性期的≥2倍表示有意义的差异；两者相差＜1.5倍为实验误差；两者相差1.5倍或以上但不到2倍，需重复测定，如仍相差1.5倍或以上但不到2倍，可判为有意义差异。如重复测定相差为＜1.5倍，表示为实验误差。

不配对血清测定时，2mm孔径的，溶血圈直径需≥4mm（溶血圈面积≥9.42mm2）；3mm孔径的，溶血圈直径需≥5mm（溶血圈面积≥12.57mm2）可认为是阳性血清。

12．注意事项

（1）抗原量一定要掌握准确，量过大一方面使测定敏感性下降，另一方面由于过量的病毒颗粒吸附在红细胞表面，红细胞不易吹散开，铺板时易出现芝麻样颗粒，过少的红细胞溶解不清晰或不溶解。

（2）血清尽量避免反复冻融，因反复冻融会产生抗补体影响溶血圈的清晰度。

（3）双份配对的血清应在同一块板上进行测定，以便避免板间的误差。 （4）阳性对照血清，有时由于滴度过高，出现很大的溶血圈，把邻近的孔覆盖，因此，最好靠近它的孔不加样本或将阳性血清进行适当稀释，如1∶5稀释，而后使用之。

（5）对患者进行血清学诊断时，建议用3mm孔径的孔，因用2mm孔径有时会出现重叠溶血圈影响结果准确的判断。进行血清流行病学调查时建议用2mm孔径。

（6）测量溶血圈直径时，应测量最清晰的，因标准的溶血圈常为靠近孔边缘出现清晰透亮的溶血圈，它的外围出现不十分清晰的溶血圈，此溶血圈外围又有个清晰的溶血圈，这是要测量的直径。测量时，尺子要挨在扩散板上。

（7）正常红细胞对照板所出现的溶血圈面积与实验板几乎一样大小，表明嗜异性抗体未完全去除干净，应再用鸡红细胞进行再吸附来去除之；如对照板所出现的溶血圈面积比实验板小2倍或以上，一般不影响对实验结果的判断。

（8）琼脂糖最好用高纯度，低熔点，在有效期内，新鲜配制的，配好后保存期不超过一个月，因保存期过长，铺板时易造成琼脂板出现裂缝。

（9）一定要加1‰NaN3以防止细菌生长，因细菌会造成非特异性溶血。 （10）温度一定要控制好，因补体不耐热，操作补体时间尽量要缩短，并在4℃下操作；补体一定为≥6只豚鼠的混合血清。

（11）禽类血清不结合豚鼠补体，不应用鸡的抗血清作为阳性对照血清。 （12）如缺乏时间对实验结果进行观察和测量，可将实验板置4℃冰箱，至少一星期进行测量不影响实验结果；溶血板制备完后，平放带湿度的盒中，置4℃冰箱，最长只能存两星期。

三、A型流感病毒RT-PCR检测

（一）生物安全要求

分装标本、裂解病毒需在BSL-2级实验室生物安全柜内操作。核酸检测区域要分出试剂配制、核酸提取、扩增、检测的不同分区。

（二）主要材料

1．提RNA Kit：QIAGEN RNeasy Mini Kit （catalog #74104） 2．β－巯基乙醇（SIGMA β-Mercaptoethanol Lot 062K0115） 3．70％乙醇

4．RT-PCR Kit：QIAGEN One step RT-PCR Kit（catalog #210212） 5．Promega RNasin Ribonuclease Inhibitor （catalog #N2111）

6．检测引物：Forword and Reverse Primers（均为10μM），序列如下：

类型 甲型通用

（三）实验步骤 1．RNA提取

FluA-M-F30 FluA-M-R264 序列 5’- TTC TAA CCG AGG TCG AAA CG -3’ 5’- ACA AAG CGT CTA CGC TGC AG -3’ （1）根据标本数量分装RLT液：从Kit中取出RLT液，用1.5mL离心管分装，每管500μL（在体系配制区操作）。

（2）加标本100ul到裂解液中。

（3）每管分别加入5μL β-巯基乙醇，混匀后依次加入600μL 70%的乙醇，充分混匀。

（4）从Kit中取出带滤柱的2mL收集管，打开包装将其做好标记。取步骤2中的混合液600μL加入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃收集管中的离心液。

（5）滤柱仍放回收集管上，将步骤2剩余的混合液全部吸入滤柱中，12000rpm，离心15s，弃离心液。

（6）于滤柱中加入700μL Wash Buffer RW1液，12000rpm，离心15s。 （7）从QIAGEN RNeasy Mini Kit中取一支干净的2mL收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，12000rpm，离心15s。

（8）弃收集管中的离心液，再于滤柱中加入500μL Wash Buffer RPE液，13000~14000rpm，离心2min。

（9）将滤柱移到一个干净的1.5mL eppendorf管上，向滤柱中加入30~50μL的Rnase-free Water，室温静置1~3min。

（10）12000rpm，离心1min，收集离心液即为提取的病毒RNA，立即做实验或-20℃以下保存。

注意：Buffer RPE使用之前加无水乙醇。 2．反应体系配制

（1）实验设计：检测标本RNA时，阴性对照用无菌水，阳性对照用已知

病毒RNA。

（2）PCR反应体系配制（在体系配制区配反应液）

组 分 5×RT-PCR Buffer 10mM dNT …… 此处隐藏：2395字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……