5湖南省2010年度人感染高致病性禽流感监测实施方案(6)

（1）每孔加入25μL PBS。

（2）A1加入25μL标准诊断血清作为阳性对照；A2加入25μL H5N1阴性血清作为阴性对照。

（3）自A3孔开始分别加入25μL待检血清；

（4）用多道加样器吸取25μL血清（A1-A12），由A行至H行做2倍系列稀释血清，至H行后弃去25μL。系列稀释时需注意每一次稀释都应混合均匀。

（5）加入25μL含4个凝集单位的抗原。 （6）混匀后室温孵育30min。

（7）每孔加入50μL 1%马红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。

（8）室温孵育45-60min，观察红细胞凝集抑制试验结果。 （9）结果判定

当特定的抗体与相应的红细胞凝集抗原结合后，可以抑制病毒引起的红细胞凝集现象。红细胞凝集抑制效价是指抑制红细胞凝集出现时血清的最高稀释度的倒数。如1:80稀释的血清孔不出现凝剂（红细胞凝集完全抑制），1:160稀释的血清孔出现凝集（无红细胞凝集抑制），该血清对测定病毒的红细胞凝集抑制效价为80。人血清对H5N1抗原的抑制效价≥1:160可判定为阳性（参考WHO推荐标准），但还需要用另一种血清学方法验证。

二、流感/禽流感单放射免疫扩散溶血技术抗体检测 （一）生物安全要求

抗原的制备和血清灭活根据所从事病毒的种类在相应的生物安全级别实验室进行，SRH检测在生物安全二级（BSL-2）实验室进行操作。

（二）材料 1．Alsever’s 液 2．pH 7.2 PBS缓冲液

3．10%叠氮钠（sodium azide， NaN3）溶液 4．5×10-4mol/L KIO4（过碘酸钾）溶液

11.5 mg KIO4加入pH7.2 PBS 溶液至100mL，完全溶解后置4℃保存。 5．1%琼脂糖 6．1%鸡红细胞悬液

7．浓鸡红细胞（洗涤后去掉上清的鸡红细胞） 8．补体的制备

至少6只健康成年豚鼠，采血前一天下午禁食，第二天上午从心脏采血，每只可采5～10mL，每只采完后速至冰上，多只豚鼠血清混匀后使用，当天分离血清，分装，置-70℃冰箱中保存。由于补体耐热性差，因此，操作时尽量在4℃条件下进行。

9．抗原

一般采用接种鸡胚尿囊腔后收获的流感/禽流感病毒液，甲醛灭活的病毒需在-70℃中保存，并且注意避免反复冻融。

10．参比血清

抗H5N1病毒兔血清及普通流感病毒参比兔血清。

11．测定血清

血清检测前56℃ 30min灭活去除血清中不耐热的非特异性抑制素和补体；血清从56℃水浴箱中取出，置室温冷却，每管加终浓度为20%的浓鸡红细胞，混匀，置室温1h或4℃过夜，1500rpm离心10min，弃沉淀物，留上清。红细胞吸附的目的是去除人血清中可能含有对鸡红细胞的嗜异性抗体（Forssman’s antibody）。

12．免疫扩散板

13．打孔器，孔径为2mm和3mm的打孔器。 14．小烧杯，带盖的可装扩散板的塑料盒。

15．测量放大镜（带有每个刻度0.1mm的刻度尺）或一般透明并带刻度的尺子。根据测量的溶血圈直径，可按下列公式计算出溶血圈面积（S）：

S1=πR12 S2=πR22 S=S1-S2

如用3mm孔径，测量的溶血圈直径为8mm，代入上述公式就可算出溶血圈面积：S1=πR12 = π×42=3.1416×16=50.27（mm2）

S2=πR22=π×1.52=3.1416×2.25= 7.07（mm2） S=S1-S2=50.27-7.07=43.20 （mm2） （三）实验步骤

1．病毒抗原红细胞凝集滴度的测定及1000个红细胞凝集单位计算 （1）病毒抗原红细胞凝集滴度的测定

采用鸡血球，按常规流感病毒96孔微孔板进行病毒滴度测定。 （2）1000个红细胞凝集单位计算

根据红细胞凝集滴度算出1000个红细胞凝集单位所需测定病毒的量。如病毒滴定时红细胞凝集滴度为64，则按下列公式计算：

0.05:64=x:1000, x =（0.05×1000）/64=50/64=0.78（mL）

也就是说，每0.1mL浓的鸡红细胞中需要加入0.78mL测定的病毒溶液。按这个比例算出实验所需的病毒量。

2．溶解1%琼脂糖并恒温于60℃水浴箱中。