5湖南省2010年度人感染高致病性禽流感监测实施方案(4)

附表4、环境标本采样登记表

采集地点 ： 县（市、区） 乡（镇） 村（居委会）

标本编号 采集日期 采集地点 标本种类 备注

注： 标本编号原则：（1）环境标本代号： C

（2）年份：10，表示2010年 （3）网络实验室流水号，见附录3 （4）实验室标本编号：从001开始

例如：长沙市疾病预防控制中心标本 C1055001

岳阳市疾病预防控制中心标本 C104306001

采集人： 采样单位 ： 送检日期：

附表5、环境标本病原学检测结果表

检测单位 ：

采用的检测方法：One-step PCR： Real time PCR： 1. One-step 试剂盒 2. Real-time 试剂盒： 3. 引物来源： 4. 检测结果 标本编号 采样日期 检测结果 A型 B型 H5 N1 其他 阴性 备注

操作者： 检测日期： 复核者：

附录1、标本的采集、处理、保存与运输

一、标本采集与处理 1. 血清标本

取真空负压采血管，做好标记，采集监测对象空腹静脉血5mL。然后置于室温数小时待血完全凝固。1500rpm～2000rpm离心10min，收集血清分装于3支带外螺旋盖的冻存管中，做好标记。

2. 环境标本

环境标本采样液可使用Hank's或Eagle's等培养液加入以下抗菌素和0.5%BSA：氨苄青霉素(2x106 IU/L)、链霉素(200mg/L)、多粘菌素B(2x106 IU/L)、庆大霉素(250mg/L)、制霉菌素(0.5x106 IU/L)、盐酸氧氟沙星(60mg/L)、磺胺甲基异恶唑(0.2g/L)。

标本采集后应在4℃条件下48小时内运送至流感监测网络实验室。实验室收到标本后应立即进行标本处理。每份原始标本分装成三份，1份用于本实验室的核酸检测，1份送省疾控中心复核，1份备送国家流感中心复核。要保证送国家流感中心的标本足量：水标本不少于3ml，拭子标本不少于2ml。

各网络实验室收到标本后1周内完成对标本的核酸检测，首先进行A型流感病毒核酸检测，对于A型阳性标本需进一步进行H5N1亚型检测。

（1）水标本

在禽类活动或笼具旁的水沟或水池的不同部位共收集水标本15-20ml置于50ml外螺旋盖的管内。水样标本到实验室后应在采样管中加入上述抗生素和0.5%BSA，再进行分装。呼吸道和环境标本要在无菌条件下反复吹打收集的溶液，以便打碎粘液和固体，置4℃待其自然沉淀5～10min，取上液分装。分装好留1份进行核酸检测。

（2）笼具表面标本

用沾有采样液的带有聚丙烯纤维头的拭子擦拭笼具表面3-5个不同部位，然后将擦拭过的拭子放入含5ml采样液的采样管中，尾部弃去。分装前务必充分震荡。

二、标本保存和运输 1．标本保存

血清标本可置4℃存放3天，存放超过3天需置-20℃或以下保存。 环境原始标本可置4℃存放2天，存放超过3天需置-70℃或以下保存。环境阳性标本至少保存1年，阴性标本至少保存6个月。

2. 标本运输

各网络实验室在完成检测后1周内将原始样本送省疾病预防控制中心微生物检验科复核。运输中，标本应放入专用运输箱内（或疫苗冷藏包），放入冰排，然后以柔软物质填充，内衬具吸水和缓冲能力的材料。同时寄送标本登记表。运输要求符合国家生物安全有关规定。病原学标本按B类感染性物质进行运输，航空采用UN3373包装。

三、湖南省疾病预防控制中心标本接收单位和联系方式

联系电话：0731－84305932

传真：0731－84305931 结果提交邮箱：hncdclbk@163.com

附录2、实验室操作方法简介

一、马红细胞血凝抑制试验检测禽流感抗体 （一）生物安全要求

禽流感H5N1亚型检测抗原的灭活需要在BSL-3 级实验室进行。其余操作均在BSL-2级实验室进行。

（二）材料

1．抗原：灭活的H5N1流感病毒。

2．血清：（1）阳性对照血清；阴性对照血清（2）待检血清 3．其他主要试剂：

（1）马红细胞（1:1的比例保存于阿氏液中，建议采血后72小时内使用）（2）磷酸盐缓冲液（PH 7.2 PBS）：0.01M；（3）牛血清白蛋白（BSA）；（4）霍乱滤液（RDE）

4．其他：

（1）“V” 型96孔微量板 （2）37℃及56℃水浴锅 （3）台式离心机 （4）多道可调加样器 （5）离心管 （三）质量控制 1、对照血清

每块96孔板上均需要设立阳性对照和阴性对照，同批次的阳性对照结果 滴度应保持2倍以内。 2、红细胞对照

实验可根据红细胞对照来判断反应时间，尽可能在每块96孔板上设计一 孔红细胞对照（PBS+1%红细胞悬液）。 3、病毒回滴

一个红细胞凝集单位指能引起等量标准化的红细胞凝集时病毒的量。进行红细胞凝集抑制试验时一般用4个红细胞凝集单位（指25μL体积中含有4个红细