5湖南省2010年度人感染高致病性禽流感监测实施方案(5)

胞凝集单位）的病毒量。

（四）实验步骤 1、血清处理

（1）用单道加样器吸出1体积血清置于无菌Eppendorf管内，换滴头加入4体积RDE，吹打混匀。

（2）置37℃水浴16～18h。

（3）从37℃水浴取出后置56℃水浴30min灭活。

（4）马红细胞吸附：瞬时离心，待冷却后加入清洗后的浓红细胞达20%（每100μLRDE处理过的血清加入20μL清洗后的浓红细胞）。混匀后室温吸附1 h。

（5）2000rpm离心5min。

（6）小心吸取上清液至干净离心管中备用。如不需立即检测可放4℃保存。 2．马红细胞的采集及1%马红细胞悬液的配备

（1）在注射器里放入一定体积的阿氏液，从颈静脉处采集马血后放入容器中，轻柔混匀，如阿氏液不足则需补足（阿氏液和红细胞的比例为1:1）。

（2）采集的马红细胞应放入冰箱4℃保存，越新鲜越好，建议在采集后72小时内使用。

（3）在配置1%马红细胞悬液前需清洗红细胞液。首先加入5mL红细胞（沉积在容器底部的红细胞）至50mL离心管。加入45mL PBS-0.5% BSA使总体积达到50mL，轻柔混匀。

（4）2000rpm(600×g) 离心5 min。

（5）吸掉上清液后，连续重复步骤（3）-（4）两次。

（6）为了精准马血球的浓度，取浓缩后的马血球1ml于1.5ml离心管中，3600g（8000rpm）离心10min，吸取压缩后血球的上清并统计出吸取上清的体积，计算实际的血球百分比（一般达到未压缩前体积的60-75%）。将完全压缩后的马血球弃去。

（7）计算最终的血球量使浓度达到完全压缩后的1%，取所需洗好马血球的体积加入PBS-0.5% BSA中，每次用前轻轻混匀后使用。

3．制备用于红细胞凝集抑制试验的4个红细胞凝集单位的抗原

（1）将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行

方向称行，如A1～A12称为A行。标记好标准诊断抗原及加样顺序。

1）吸取50μL PBS加入微量板的第二列至最后一列，于第一列加入100μL标准诊断病毒。

2）从第一列取50μL病毒液，依次从第二列至第八列做2倍系列稀释。最后一列每孔弃去50μL稀释后的病毒液。

3）每孔加入50μL 1%的红细胞悬液，轻弹微量板，使红细胞与病毒充分混合。

4）室温孵育45～60min，观察红细胞凝集现象并记录结果。

5）结果判定：红细胞凝集滴度的判定以出现完全凝集的最高稀释度为终点，其稀释度的倒数即为病毒的红细胞凝集滴度。红细胞完全凝集以“+”记录；无凝集或部分凝集“-”记录。

（2）制备4个红细胞凝集抗原时：首先计算出红细胞凝集抑制试验所需的病毒抗原的总量。如每份血清作8孔稀释，每孔用抗原25μL抗原，那么测定一份血清需0.2mL抗原。根据参比血清的份数计算出实验所需病毒抗原量，然后配制抗原。

（3）计算出病毒稀释度。用病毒红细胞凝集滴度（HA滴度）除以8，得到的商即为4个红细胞凝集单位的稀释度。如，某病毒的HA滴度为64，除以8等于8。按1:8（1mL病毒液加7mL PBS）稀释该病毒即可得到4个凝集单位/25μL的抗原病毒量。

（4）为了保证红细胞凝集抑制试验中抗原用量一致并且准确无误，新配制的4个凝集单位抗原须复核滴定：取50μL稀释好的抗原，用等量PBS做倍比稀

释（同病毒滴定）后加入50μL红细胞悬液，至室温孵育45～60min后观察凝集结果。如只有前4孔出现凝集，表明每50μL病毒含有8个凝集单位（即25μL中含有4个红细胞凝集），该病毒稀释准确，可以用于红细胞凝集抑制试验。如第5孔也出现凝集，说明每50μL病毒含有16个凝集单位，该抗原必须等量稀释。如只有前3孔凝集，表明每50μL病毒仅含有4个凝集单位，病毒量需要加倍。此外，4个凝集单位抗原必须每次用前新配制。

4．红细胞凝集抑制试验（HI）检测血清抗体

将微量板横向放置：垂直方向称列，如孔A1～H1称为第一列；平行方向称行，如A1～A12称为A行。标记好待检病毒的实验室编号及加样顺序。