本科毕业论文参考格式(4)

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4）质粒的制备：将留菌种后剩余菌液全部用于质粒制备，具体操作步骤按生工生物 (上海)有限公司质粒小提试剂盒操作说明进行；

5）双酶切：用EcoRⅠ和XhoⅠ对所提质粒进行酶切，37℃水浴2h； 酶切体系（μL）： pet28a-sm29 plasmid

10×H buffer EcoR I Xho I ddH2O 总体积

6 1 0.5 0.5 2 10

6）琼脂糖凝胶电泳：分别将酶切产物与2μL 6×loading buffer充分混合，开始上样，上样顺序为： DNA marker DL2000，酶切产物。90V，电泳30min； 7）小心将胶取出并于紫外灯下观察、拍照； 2.2.2 重组的Sm29基因在大肠杆菌中的表达

2.2.2.1重组表达质粒 pET28a-Sm29转化至感受态细胞BL21进行原核表达 将鉴定正确的重组表达质粒 pET28a-Sm29 1μL转化至200μL BL21感受态细胞,转化步骤同前述； 2.2.2.2 IPTG诱导表达蛋白

1）无菌操作台中，挑取单个重组菌落，接种于3mL 1mmol/L卡那霉素溶液的LB离心管中，于37℃，210rpm振荡培养12-16个小时；

2）留菌种：无菌操作台中，100μL 30%无菌甘油加100μL过夜菌液，混合均匀，做好标记，于－20℃保存；

3）无菌操作台中，取200μL过夜菌，接种于10mL 1mmol/L卡那霉素溶液的LB离心管中，于37℃，210rpm振荡培养；

4）培养1h后打开紫外分光光度仪预热，1.5h后无菌操作台中，取1mL菌液测OD600=0.6-1.0之间，如果没有达到0.6，继续培养，20min后再测，直至OD600=0.883；

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5）无菌操作台中，取1mL菌液留用向剩余菌液中加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L继续培养，分别在 1h、3h、5h 收集 1mL菌液留用；

6）将上述培养不同时刻的菌液1200rpm离心2min，弃上清；沉淀用50μL 1×PBS重悬；

7）加入等量的2×SDS蛋白上样缓冲液重悬后，沸水浴8min 处理后做 SDS-PAGE； 2.2.2.3 SDS-PAGE 操作步骤

1) SDS-PAGE12%凝胶配制，配方如下: 去离子水 30%丙烯酰胺溶液

1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 缓冲液 0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液 10%SDS 10%过硫酸铵 TEMED 总体积

12%分离胶 1.6mL 2.0mL 1.3mL － 50μL 50μL 2μL 5mL

5%浓缩胶 1.4mL 0.33mL － 0.25mL 40μL 40μL 2μL 2mL

2）安装好玻璃板，迅速在两玻璃板间灌注 12%分离胶溶液，预留 1.5cm 灌注浓缩胶，在丙烯酰胺溶液上层轻轻覆盖双蒸水或异丙醇，将凝胶置于37℃恒温箱中30min；

3) 分离胶聚合后倾出覆盖液体，并用滤纸吸净残留液体；

4) 在已经聚合的分离胶上直接灌注浓缩胶，立即插入梳子，避免气泡产生； 5) 浓缩胶聚合后小心拔出梳子，立即用水洗涤加样槽，以除去未聚合的丙烯酰胺； 6) 安装好电泳装置，内外槽都加入电泳缓冲液，用微量加样器在加样孔加入样品和低分子量蛋白质标准，蛋白样品上样量每孔20μL，蛋白分子量标准3μL，上样顺序：0h样品，1h样品，3h样品，5h样品，蛋白分子量标准；

7) 电泳:浓缩胶 55V，30min，分离胶 110V，60min，直至溴酚蓝到达分离胶的底部，关闭电源；

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8) 剥胶及染色：取出凝胶放入考马斯亮蓝R-250染色液中，置脱色摇床缓慢摇动10-16h；

9) 脱色:去净染液后，加脱色液置脱色摇床上缓慢摇动，至背景干净条带清晰为止。观察重组蛋白条带的有无和位置。

2.2.3 rSm29融合蛋白免疫印迹法(Western blotting)鉴定

蛋白按常规进行SDS-PAGE，上样顺序：蛋白分子量标准，未诱导样品，诱导5h样品；NC膜电转印，5%脱脂奶粉4℃封闭16-18h，取出后加入抗6×His-Tag(用封闭液按1:100稀释)37℃孵育2h，PBST洗涤后用HRP-标记的山羊抗兔IgG(用PBST 1:20,000稀释) 37℃孵育1h，PBST洗涤后行化学发光(ECL)显色。 2.2.3.1样品 SDS-PAGE

样品 SDS-PAGE 同前，上样顺序：蛋白分子量标准，未诱导样品，诱导5h样品，未诱导样品，诱导5h样品； 2.2.3.2 半干转膜

1) 电泳结束后，戴上手套，准备好一张NC膜和2张滤纸，大小应与凝胶大小吻合，将膜、滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中；

2) 在半干转膜仪上从下到上依次铺上滤纸，NC膜，精确对齐，勿有气泡； 3) 从电泳槽上撤下放置 SDS-PAGE 凝胶的玻璃，小心将凝胶铲起，平铺在NC膜上，精确对齐，然后用一玻璃棒做滚筒以挤出气泡； 4) 最后将滤纸和海绵放在凝胶上方，各层精确对齐并排除气泡； 5) 盖好转膜仪顶盖，接通电源，恒压15V，转移22min；

6) 断开电源，凝胶同前进行染色，以便检查蛋白质是否转移完全； 2.2.3.3 封闭

1) NC 膜转移至含有1×丽春红染液的平皿中，轻轻摇动染色 10min 左右； 2) 蛋白条带出现后，将膜按泳道剪出条带（暂不剪断），同时在目的条带上下用圆珠笔做好标记，再用自来水漂洗NC膜，摇床脱色直至颜色褪去； 3）封闭：把膜放入5%脱脂牛奶封闭液（用PBST配制），4℃，摇床过夜； 2.2.3.4一抗孵育

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1）剪下每个条带，剪成合适尺寸，取出0h和5h条带装入用抗6×His-Tag抗体，封闭液按1:100配成的EP管中，另取出0h和5h条带装入用纯化抗rSj29小鼠单克隆抗体腹水，封闭液按1:100配成的EP管中，将两支EP管37℃恒温孵育2h；

2）将EP管中的条带取出放入平皿中，用PBST洗4次，每次15min； 2.2.3.5二抗孵育

1) 将用抗6×His-Tag抗体孵育的条带放入用PBST以1:20,000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG的平皿；将用纯化抗rSj29小鼠单克隆抗体腹水孵育的条带放入用PBST以1:20,000稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG的平皿，将两个平皿37℃恒温孵育1h； 2）用PBST漂洗条带4次，每次15min； 2.2.3.5 化学发光(ECL)显色并拍照。

3 实验结果

3.1 Sm29基因克隆的酶切鉴定

分别将pET28a和pUC57-Sm29∕XLI-Blue阳性克隆进行双酶切(EcoRⅠ和Xho

Ⅰ)鉴定。产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，分别得到长约5000bp的片段（大片段）和约570bp的片段（小片段），其酶切图谱与预期一致，可进行下一步胶回收，如图1所示。

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图 1 pET28a质粒和pUC57 -Sm29 重组质粒的双酶切鉴定

1: pET28a质粒双酶切产物，2: pUC57 -Sm29 重组质粒双酶切产物， M:DL 2000 Marker Fig.1 restriction endonuclease analysis of pET28a plasmid and pUC57-Sm29 recombinant plasmid

3.2 重组表达质粒 pET28a-Sm29的双酶切鉴定及蛋白表达

pET28a-Sm29重组质粒分别用EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定，分别得到长约570bp的片段，其酶切图谱与预期一致，如图2所示。诱导前及诱导后各时相的蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳检测，诱导后有新条带出现，该条带与目的条带大小相近，在约21KD处见明显的特异性蛋白质区带，如图3所示。

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