本科毕业论文参考格式(3)

安徽医科大学本科毕业论文

考马思亮蓝染液 脱色液

SDS-PAGE 电泳缓冲液

0.25g 考马思亮蓝 R250 溶于 100ml 脱色液中，用 1 号 Whatman滤纸过滤后，室温保存。

按甲醇:冰乙酸:水=45:10:45 比例配制，室温保存。 甘氨酸 Tris 10%SDS

去离子水加至 1000ml。

18.8g 3.02g 10.0ml

丽春红染液的配制

丽春红 三氯乙酸 磺基水杨酸

2.0g 30.0g 30.0g

溶于 100ml 水。使用时取 1 份上述贮存液加 9 份去离子水即可。

转移缓冲液

甘氨酸 Tris SDS 甲醇

去离子水加至 1000ml。

2.90g 5.80g 0.37g 200ml

2.1.4 实验主要仪器 LQG157A 台式高速离心机 凝胶成像系统

UV-2102C 型紫外可见分光光度计 DK-8D 型电热恒温三孔水槽 隔水式恒温培养箱 FA1104 电子天平 PHS-3D 精密数显酸度计 TY-80R 脱色摇床

珠海黑马医学仪器有限公司 天能科技（上海）有限公司 尤尼柯(上海)仪器有限公司 上海跃进医疗器械有限公司 上海一恒科技有限公司 上海精密科学仪器厂 上海天达仪器有限公司 江苏金坛市医疗器械厂

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WD-9405B 型水平摇床 微波炉 电泳仪

U410-86 超低温冰箱 普通冰箱

SW-CJ-IB型单人单面净化工作台 纯水机 HVE-50高压锅 CXG-1电脑恒温层析柜 HJ-2双头磁力加热搅拌器 Trans-Blot SD半干转膜仪 制冰机

北京六一仪器厂 格兰仕电器公司 BIO-RAD公司 NBSC 公司 合肥美菱冰箱厂 苏州净化设备有限公司 艾科浦公司 Hirayama公司

上海沪西分析仪器厂有限公司 金坛市杰瑞尔电器有限公司 BIO-RAD公司 SANYO公司

4500SF全自动数码凝胶化学发光图天能科技（上海）有限公司 像分析系统

DNP-9162电热恒温培养箱 2.2 实验方法

2.2.1 Sm29基因原核表达重组质粒的构建和鉴定 2.2.1.1 细菌的培养及阳性克隆的挑选保存

1）无菌操作台中，取实验室冻存的已测序鉴定过的菌种pUC57-Sm29∕XL1-Blue一支，融化后用接种环沾取少量菌液,在含氨苄青霉素(Amp)抗性的LB固体培养基上进行四区划线；

2）另取实验室冻存的pET28a∕XL1-blue空表达载体一支，融化后用接种环沾取少量菌液，在含卡那霉素（kana）抗性的LB固体培养基上进行四区划线； 3）做好标记，将两块平皿置于37℃恒温培养箱中倒置培养12-16个小时； 4）无菌操作台中，分别挑取单个菌落，接种到3mL 1mmol/L相应抗生素的液体LB的离心管中，于37℃，210rpm振荡培养12-16个小时；

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上海三发科学仪器有限公司

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5）留菌种：无菌操作台中，100μL 30%高压过的甘油加100μL过夜菌液保存至0.5mL EP管中，混合均匀，做好标记，于－20℃保存（长期保存应放置于－80℃或液氮中）； 2.2.1.2 质粒的制备

将留菌种后剩余菌液全部用于质粒制备，具体操作步骤按生工生物 (上海)有限公司质粒小提试剂盒操作说明进行。 2.2.1.3 质粒DNA的限制性内切酶酶切鉴定

1）双酶切：用EcoRⅠ和XhoⅠ同时双酶切重组pUC57-Sm29载体和空表达载体pET28a，37℃水浴2h； 酶切体系（μL)：

plasmid 10×H buffer EcoR I Xho I ddH2O 总体积

pUC57-Sm29

6 1 0.5 0.5 2 10

pET28a 6 1 0.5 0.5 2 10

2） 琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）：分别将酶切产物与2 μL 6×loading buffer充分混合，开始上样，上样顺序为： pET28a酶切产物，pUC57-Sm29酶切产物，DNA marker DL2000。90V电泳30min； 3）小心将胶取出并快速于紫外灯下观察、拍照； 2.2.1.4 DNA片段的回收

1）将酶切鉴定结果正确的重组pUC57-Sm29载体和空表达载体pET28a质粒用EcoRⅠ和XhoⅠ同时进行双酶切，37℃水浴2h； 酶切体系（μL)：

plasmid 10×H buffer EcoR I

pUC57-Sm29

12 2 1

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pET28a 12 2 1

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Xho I ddH2O 总体积

1 4 20

1 4 20

2） 琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）：分别将酶切产物与4μL 6×loading buffer充分混合，开始上样，上样顺序为： pET28a酶切产物，pUC57-Sm29酶切产物，DNA marker DL2000。90V电泳30min； 3）小心将胶取出并快速于紫外灯下观察；

4） 将鉴定正确的片段进行胶回收,按生工生物 (上海)有限公司胶回收试剂盒操作

说明进行：分别回收重组的pUC57载体上的目的片段(小片段)和表达载体pET28a上的载体片段(大片段)；

5）将部分胶回收产物进行琼脂糖凝胶电泳（1%琼脂糖凝胶）鉴定，拍照； 2.2.1.5 目的片段与表达载体的连接（DNA重组）

将鉴定正确的胶回收产物部分用于连接：按6:2摩尔比将此二片段4℃连接过夜；

连接体系（μL)：

Sm29 pET28a T4 ligase T4 buffer 总体积

6 2 1 1 10

2.2.1.6 CaCl2法制备XL1-BLue感受态细胞(BL21感受态细胞制备方法相同) 1) 从－80℃冰箱取 XL1-BLue 菌种，无菌操作台中在 LB(无抗生素)平板上划线，37℃生化培养箱过夜培养(14-16h)；

2) 从新鲜平板上挑取一个单菌落，转到含有 3mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜；

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3) 将菌液按 1:50 的比例接种到 LB 培养基中，37℃ 210rpm培养至 OD600约为 0.3到 0.5(对数生长前期或对数生长期)，然后置于冰浴中 30min； 4) 无菌操作台中，用预冷的 1.5mL 离心管收集菌液，4℃ 4000rpm离心 5min； 5) 弃上清，用预冷的 0.3ml/管 0.1M CaCl2重悬菌体，冰水浴 10min，然后 4℃4000rpm 离心 5min；弃上清，加入预冷的 0.1MCaCl2 0.12mL/管，轻轻重悬菌体，置于冰水浴中 15min；

6) 加入等体积的 30%无菌甘油，混匀后立即置于-80℃保存。 2.2.1.7 连接产物转化至XL1-BLue感受态细胞扩增重组质粒

1) 无菌操作台中，在一EP管中将10μL连接产物加入到一支200μL XL1-BLue感受态细胞中轻轻混匀； 2) 冰浴30 min；

3) 42℃水浴1.5 min(热休克)，不摇动管，立即至冰浴2 min； 4) 无菌操作台中，每一EP管加400μL 液体LB培养基；

5) 37℃，150rpm，温育45 min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；

6) 12000 rpm，2min，离心，弃400μL上清；

7) 无菌操作台中，剩余重悬菌体，将其加入含质粒编码的抗生素抗性的固体LB平皿，并用涂布器涂布；

8) 37℃孵育箱放置20 min，待铺板菌液被吸收； 9) 37℃孵育箱倒置过夜。

2.2.1.8阳性克隆的挑选、鉴定及保存

1）无菌操作台中，挑取前日转化的pET28a-Sm29 (XL1-Blue)单菌落接种到3mL 1mmol/L卡那霉素抗性的液体LB的离心管中，于37℃，210rpm振荡培养12-16个小时；

3）留菌种：无菌操作台中，100μL 30%高压过的甘油加100μL过夜菌液保存至0.5mL EP管中，混合均匀，做好标记，于－20℃保存；

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