本科毕业论文参考格式(2)

安徽医科大学本科毕业论文

pET28a-Sm29 was constructed and transferred into E.coli BL21/DE3. The positive recombinant pET28a-Sm29 was screened and identified by agarose gel electrophoresis and endonuclease digestion. The BL21/DE3 which was transformed with pET28a-Sm29 was induced by IPTG, and the expressed protein was analyzed by SDS-PAGE and Western-blotting.

Results: The specific fragment of Sm29 was amplified and the recombinant prokaryotic expression plasmid pET28a-Sm29 was successfully constructed. After being induced by IPTG, the transformed BL21/ DE3 expressed an about 21 kDa protein which was fused with His-tag. This protein could be recognized by anti-6×His-Tag antibody and could not be recognized by anti-rSj29 monoclonal antibody in Western-blotting.

Conclusion: There is no value of anti-rSj29 monoclonal antibody on detection of rSm29. （以上为：小四号Times New Roman）

Key words Schistosoma mansoni / membrane protein / prokayotic expression

曼氏血吸虫 Sm29基因原核表达质粒的构建（小二号黑体）

1 前言（一级标题，四号黑体，下同）

血吸虫病(schistosomiasis)是由寄生于人体的血吸虫引起的以虫卵肉芽肿和肝纤维化为主要特征的人兽共患寄生虫病，呈世界性分布。2001年10月9日至14日世界卫生组织（WHO）在日内瓦召开的预防与控制血吸虫病和土源性蠕虫病专家委员会联席会议讨论中指出，目前人类血吸虫病主要由曼氏血吸虫(S. mansoni)、日本血吸虫(S. japonicum)、埃及血吸虫(S. hacmatobium)、间插血吸虫（S. intercalatum）和湄公血吸虫（S. mekongi）引起，主要流行于发展中国家[1]。就人

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体感染寄生虫后死亡率而言，血吸虫病在全球范围是最严重的[2]，全球每年仍有 2 亿人口感染血吸虫病并有25万人死于血吸虫病。就疾病引起的社会经济负担与公共卫生重要性而言，目前血吸虫病依然是不容忽视的全球性社会公共卫生问题[3,4]。

曼氏血吸虫病是血吸虫病中分布最为广泛、病人数最多的，其分布于阿拉伯半岛、非洲和拉丁美洲的54个国家，受威胁人数约4～5亿[5]。我国虽然不是曼氏血吸虫主要流行地区，但是近年来，随着外出旅游、务工人群的增加，这些人群很可能在流行地区感染曼氏血吸虫病并将疾病带回国内，因此，如何及早诊断曼氏血吸虫病也是我们需要密切关注的问题。

血吸虫病诊断主要包括病原学诊断和免疫学诊断。病原学诊断是曼氏血吸虫病的主要确诊方法，但由于病原学诊断费时、费力，人群的依从性逐渐下降，更主要的是其敏感性不高（特别是对轻度感染者），故限制了该法在大规模筛查中的应用[6]。免疫诊断方法具有敏感性高、使用方便等优点，已在流行区广泛应用[6-8]。

血吸虫病免疫学诊断包括抗体检测和循环抗原检测[9]。血吸虫病抗体检测方法多样，较常用的为环卵沉淀试验(COPT)、间接血凝(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和酶联免疫转移印迹(EITB)等，方法各具优缺点，目前使用最为广泛的是ELISA 和 IHA 等；循环抗原指由寄生于宿主门静脉系统内的血吸虫成虫所不断释放进入血流和尿液的分泌物、排泄物以及不断更新的表膜蛋白这些抗原物质。血吸虫循环抗原的提取，鉴定和分析研究为体液中循环抗原的检测提供了线索，随着生物技术的发展，循环抗原的检测方法也更趋敏感和特异性[10]。一般认为血吸虫循环抗原的检测具有反映活动性感染、估计虫荷和考核药物疗效的优点。上世纪80年代至今，国内外寄生虫学者已把单克隆抗体技术引入到血吸虫病防治，因而可以定性或定量检测宿主血清中循环抗原[11]。单克隆抗体是指在一株B淋巴细胞系中的每个细胞只能产生一种它所专有的、只针对一种它识别的抗原决定簇的抗体，具有理化性状高度均一、生物活性单一、与抗原结合的特异性强，少或无血清交叉反应等特点。

实习单位病原生物学教研室任翠平等[12]利用单克隆抗体技术获得了两株特异性分泌抗Sj29单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经过体外多次传代培养后，仍能分泌

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高效价的抗体，细胞上清效价稳定在 1:800~1:3200之间。用BALB/c小鼠大量制备单抗腹水并纯化第1株单抗腹水，ELISA法测效价为1.024×105以上。Western-blotting和免疫荧光定位的结果证实两株细胞均为分泌抗日本血吸虫膜蛋白Sj29单克隆抗体的杂交瘤细胞株。与此同时，制备和初步纯化多抗建立了双抗体夹心ELISA实验方法，在检测日本血吸虫病人血清中循环抗原中具有较好的初步应用价值。

曼氏血吸虫Sm29是近年来发现的一种血吸虫表膜蛋白[13]，经Blast基因序列对比发现，曼氏血吸虫表膜Sm29基因与日本血吸虫表膜Sj29基因序列具有69%的相似度，曼氏血吸虫表膜Sm29蛋白与日本血吸虫表膜Sj29蛋白氨基酸序列55%的同源性。本室已在体外成功扩增出曼氏血吸虫Sm29基因片段并进行了序列分析。本文采用基因重组技术, 将扩增得到曼氏血吸虫Sm29基因并定向克隆入pET28a(+) Vectors原核表达载体并进行了原核表达，并用Western-blotting鉴定抗日本血吸虫表膜rSj29单克隆抗体能否识别曼氏血吸虫表膜蛋白rSm29，为进一步研究抗日本血吸虫表膜rSj29单克隆抗体的作用打下基础。

2 材料与方法

2.1 实验材料（二级、三级标题，小四号黑体，下同） 2.1.1 菌株

曼氏血吸虫pUC57-Sm29∕XLI-Blue、大肠埃希菌(E.coli)菌株 XL1-Blue、BL21 和表达质粒 pET28a (+) Vectors、纯化抗rSj29小鼠单克隆抗体腹水由本室保存。 2.1.2 主要实验试剂

T4 连接酶、DL2000 Marker、低分子量蛋白Marker购自MBI公司；限制性内切酶EcoR I、限制性内切酶Xho I、DNA连接试剂盒购自Takara公司；TEMED购自Promega公司；氨苄青霉素、卡那霉素、抗6×His-Tag抗体、质粒小量抽提试剂盒及胶回收纯化试剂盒购自生工生物(上海)有限公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG购自北京中衫金桥生物技术公司；ECL化学发光试剂盒购自Pierce公司；

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NC膜购自Millipore公司；IPTG、甘氨酸、Tris 购自 Sigma 公司；琼脂、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物购自Oxoid公司；SDS、APS、考马思亮蓝、丽春红、丙烯酰胺、N，N’--亚甲双丙烯酰胺、购自 Amerasco 公司；其余试剂为国内分析纯。 2.1.3 部分试剂配制 PBS (0.01M, PH7.4)

PBST

LB 液体培养基

LB 固体培养基

氨苄青霉素/卡那霉素(100mg/ml) 20% IPTG (M/V)

50×TAE 电泳缓冲液

NaCl

8.00g Na2HPO4·12H2O 3.59g KH2PO4 0.24g KCl

0.20g

去离子水加至1000ml。

即在PBS中加Tween 20至终浓度为0.1%。 胰蛋白胨 1.0g 酵母提取物 0.5g NaCl

1.0g 去离子水加至100ml，用NaOH调PH值7.2-7.4之间，高温灭菌后储存于 4℃。

在LB液体培养基基础上按每100ml加入1.5g琼脂，高温灭菌后备用。

1.0g溶于10ml去离子水中，0.22μm滤器过滤，-20℃保存。

8ml H2O 加 2.0g IPTG 定容至 10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装1ml，-20℃保存 …… 此处隐藏：2783字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……