微生物群落多样性测序与功能分析(4)

回答：组间差异显著物种又可以称作生物标记物（biomarkers），该分析主要是想找到组间在丰度上有显著差异的物种。

14. 物种进化树的样本群落分布图

是将不同样本的群落构成及分布以物种分类树的形式在一个环图中展示。数据经过分析后，将物种分类树和分类丰度信息通过软件GraPhlAn(http://huttenhower.sph.harvard.edu/GraPhlAn )进行绘制。其目的是将物种之间的进化关系以及不同样本的物种分布丰度和最高分布样本的信息在一个视觉集中的环图中一次展示，其提供的信息量较其他图最为丰富。

中间为物种进化分类树，不同颜色的分支代表不同的纲（具体的代表颜色见右上角的图例），之后外圈的灰色标示字母的环表示的是本次研究中比例最高的15个科（字母代表的科参见左上角的图例）。之后的外圈提供的是热力图，如果样本数<=10个则绘制样本，如果样本数超过10个则按照分组绘制，每一环为一个样本，根据其丰度绘制的热力图。最外圈为柱状图，绘制的是该属所占比例最高的样本的丰度和样本颜色（样本颜色见环最下方的样本名字的颜色）。其中热力图和柱状图取值均为原比例值x10000后进行log2转换后的值

参考文献：

1. Vazquez-Baeza Y, Pirrung M, Gonzalez A, Knight R. 2013. Emperor: A tool for visualizing high-throughput microbial community data. Gigascience 2(1):16.

2. Legendre, P. and Legendre, L. 1998. Numerical Ecology. Second English Edition. Developments in Environmental Modelling 20. Elsevier, Amsterdam.

3. Segata N, Izard J, Waldron L, et al. Metagenomic biomarker discovery and explanation[J]. Genome Biol, 2011, 12(6): R60.

4. Langille MGI, Zaneveld J, Caporaso JG, McDonald D, Knights D, Reyes JA et al. (2013). Predictive functional profiling of microbial communities using 16S rRNA marker gene sequences. Nat Biotechnol 31: 814–821.

15. 物种相关性分析

根据各个物种在各个样品中的丰度以及变化情况，计算物种之间的相关性，包括正相关和负相关。

相关性分析使用CCREPE算法，首先对原始16s测序数据的种属数量进行标准化，然后进行Spearman和Pearson秩相关分析并进行统计检验，计算出各个物种之间的相关性，之后在所有物种中根据simscore绝对值的大小，挑选出相关性最高的前100组数据，基于Cytoscap绘制共表达分析网络图，网络图采用两种不同的形式表现出来。

物种相关性网络图A：图中每一个点代表一个物种，存在相关性的物种用连线连接，其中，红色的连线代表负相关，绿色的先代表正相关，连线颜色的深浅代表相关性的高低。

物种相关性网络图B：图中每一个点代表一个物种，点的大小表示与其他物种的关联关系的多少，其中与之有相关性的物种数越多，点的半径和字体越大，连线的粗细代表两物种之间相关性的大小，连线越粗，相关性越高。

参考文献：

Schwager E, Weingart G, Bielski C, et al. CCREPE: Compositionality Corrected by Permutation and Renormalization[J]. 2014.

16. 聚类分析

根据OUT数据进行标准化处理（1wlog10）之后，选取数目最多的前60个物种，基于R heatmap进行作图，热图中的每一个色块代表一个样品的一个属的丰度，样品横向排列，属纵向排列，两个热图，差异是是否对样品进行聚类，从聚类中可以了解样品之间的相似性以及属水平上的群落构成相似性。

如果聚类结果中出现大面积的白或黑是因为大量的菌含量非常低，导致都没有数值，可以在绘制之前进行标准化操作，对每一类菌单独自身进行Z标准化。