植物组织培养技术(三)

器官发生与体细胞胚胎发生一.器官发生 (一)概念：离体培养的组织、细胞在诱导条 件下经分裂和增殖再分化形成根和芽等器官的 过程。 (二)发生方式：有两种发生方式 (1)直接发生：(具有初生分生能力的)外 植体直接分化成器官的过程。(由茎尖、腋芽、 原球茎、块茎、鳞茎等器官发生) (2)间接发生：外植体(已分化的成熟组织) 经脱分化形成愈伤组织再分化形成器官的过程。

二)胚状体方式(somatic embryo) 指由培养细胞诱导分 化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整 植株。 由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶 段： 1)外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而 形成愈伤组织。这一阶段同不定芽方式一样。 2)胚状体形成 在植物有性生殖中，精于和卵子结合形 成合子，合子进一步发育成胚。但在组织培养条件下 胚状体的发育过程是：细胞经脱分化后，发生持续细 胞分裂增殖，并依次经过原胚期、球形胚期、心形胚 期、鱼雷形胚期和子叶期，进而成为成熟的有机体。 我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不经有性过程 而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。 3)胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不 定芽均有光滑、圆形突起的形状。

由外植体经胚状体形成完整植株可分三个不同发育阶段： 1)外植体细胞脱分化。外植体发生细胞分裂，或进而形成愈伤组 织。这一阶段同不定芽方式一样。 2)胚状体形成 在植物有性生殖中，精于和卵子结合形成合子，合 子进一步发育成胚。在组织培养条件下胚状体的发育过程类似于 合子胚的发育：细胞经脱分化后，发生持续细胞分裂增殖，并依 次经过原胚期、球形胚期、心形胚期、鱼雷形胚期和子叶期，进 而成为成熟的有机体。我们把由愈伤组织的类似薄壁组织细胞不 经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，称为胚状体。 3)胚状体再发育成完整植株 在外观上，这种方式和不定芽均有光 滑、圆形突起的形状。

胚状体与不定芽的区别胚状体在组织学上具备以下和不定芽不同的三个特征： ①最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段， 从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或 不定根都为单向极性。 ②胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构 上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的 维管组织相联系。 ③胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不 定芽的维管组织无此现象。 胚状体也是植物组织培养形态发生最常见而 重要的方式，它较不定芽方式有更多的优点：如胚状 体产生伪

数量比不定芽多；胚状体可制成人工种子， 便于运输和保存；胚状体的有性后代遗传性更接近母 体植株。这些对组织培养应用于育种是十分有利而重 要的。

胚状体与合子胚的比较合子胚 质量 来源 胚状体 萌发率高，质量 萌发率低，质量 好 差 受精卵 体细胞

胚柄 形态

有，明显

即使有也不明显

变异率

固定，体积相对 复杂，常有两个 较小 以上的子叶体积 相对较大 低 高

(三)影响体细胞胚胎发生的 因素

1.生长调节物质(1)生长素类：我们以离体培养条件下胡萝卜的体细胞胚胎发生的诱导过程来进 行分析(教程P99),在离体条件下胡萝卜体细胞胚的发育是一 个包括两个步骤的过程，每个步骤需要一种不同的培养基。愈伤 组织的建立和增殖所需要的是一种含有生长素的培养(增殖培养 基),通常所用的生长素是2,4-D,浓度范围0.5—1mg/L。在这 样一种培养上，愈伤组织的若干部位分化形成分生细胞团，称作 “胚性细胞团”。在增殖培养基上反复继代，胚性细胞团的数量 不断增加，但并不出现成熟的胚。然而，如果把胚性细胞团转移 到一种生长素含量很低或完全没有生长素的培养(成胚培养基) 上，它们就能发育为成熟的胚。看来，在增殖培养基中生长素的 存在，对于胚性细胞团后来在成胚培养基上发育为胚是必不可少 的。边疆保存在无生长素培养基中的愈伤组织不能形成胚。在这 个意义上，可把增殖培养基看成是体细胞胚胎发生的：诱导培养 基：,而把每个胚性细胞团看成是一个无结构的胚。

(2)细胞分裂素类： 细胞分裂素对于体细胞胚胎发生的作用有相反 的结论，既或促进也可抑制体细胞胚的发生， 这主要取决于植物的种类及其基因型。一般而 言，细胞分裂素对于促进体细胞胚的成熟有显 著作用，特别有利于子叶的发育。另外有研究 表明，不同的外植体对于细胞分裂素的需要可 能具有不同的专一性，如在胡萝卜的研究中发 现，虽然BAP和激动素对胚胎发生过程表现抑 制作用，但浓度为0.1μmol/L的玉米素却能促 进这个过程，而BA对胡萝卜则是促进其愈伤组 织的增殖，但不形成胚性愈伤组织。

(3)赤霉素类： 赤霉素类能抑制体细胞胚胎发生，但对于许多 植物而言，赤霉素对于体细胞胚胎的成熟与萌 发有促进作用。 (4)脱落酸： 抑制剂特别是ABA,在体细胞胚胎发生过程中 的作用正逐渐被提示出来，ABA是一种天然产 生的生长调节剂，当把无抑制作用剂量(通常 是0.1~1μM)的ABA用于荷兰芹属培养物时， 可以允许胚成熟过程进行。但是其抑制异常增 殖，包括不定胚的启动。另一方面抑制早熟萌 发。

2.氮源 氮源的形态有还原态氮(NH4+)和氧化态氮 (NO3—)两种。在以KNO3为唯一氮源(如 White培养基)的培养上建立起来的愈伤组织， 去掉生长素以后不能形成胚。然而是，若在培 养基中加入少量NH4Cl即可明显促进胚状体的 发育，上述结论是否说明，胚胎发生过程中还 原态氮是必需的？我们可以对以下的实验进行 分析。

Reinert及基合作者在栽培胡萝卜愈伤组织培养中( 培 养基均为White培养基)得到以下结果：[NH4+—氮](M) [NO3——氮] (M) 体胚发生数(个/2ml)

10 0 0

40 1131±219 55 19±0.3 95 11.3±4.1 从上表可以分析得出，尽管高浓度的氧化态氮同样 可以诱导体细胞胚胎发生，但是其诱导率远远低于还 原态氮和氧化态氮配合使用时的诱导率。

三.长期培养物形态发生潜力 的丧失有些愈伤组织或悬浮培养物起初具有器 官发生或胚胎发生的潜力，但经过反复 继代保存之后喧种形态发生能力常常逐 渐下降，有些甚至完全损失。为了解释 这种现象，现在有三种假说。

1.遗传说 该假说认为，形态发生潜力的丧失是由 于在培养细胞中的核的特性发生了改变， 即细胞核内的遗传物质在培养继代过程 中由于变异等原因而发生了改变或是突 变。因此，可以推知，由这种原因所造 成的形态发生潜力的丧失是不可逆的。

2.生理说 从前面体细胞胚胎发生中的甜橙的驯化 组织的形成的实例中，不难分析，随着 不断的培养继代的进行，培养组织或细 胞中的内源激素平衡关系可能会发生改 变，而导致不能形态发生。在这种情况 下，细胞虽然停止了器官和胚胎的分化， 但并不一定就丧失了这种分化能力。因 而，在这种情况下，如果改变外部处理 条件，应该有可能使细胞的这种内在潜 力得到恢复。

3.竞争说 这个假说本质上是前两个假说的结合。按照这个假说的倡议 者Smith 和Street(1974)的看法，在胡萝卜细胞长其连续继代 培养基间，有两个过程可能与胚胎发生能力的下降以至最终的丧 失有关。首先，细胞对于生长素(2,4-D)抑制全能性表达的作 用变得比较敏感；基次，随着时间的推移，由于培养细胞在细胞 学上的不稳定性，出现了缺乏胚性潜力的新的细胞系，这些细胞 学上的变化不一定是染色体数目的变化，而可能只是遗传信息的 小的突变、丢失或易位，实际上，Jones(1974)已经证实，在 胡萝卜培养物中，细胞群体在成胚能力上的不稳定性，可能是由 用于建立该培养物的组织带来的。在复杂的多细胞外植体中，只 有少数细胞能够产生胚性细胞团，其余细胞都是无法表达其全能 性的。按照这种假说，如果非胚性的细胞类型在所用的培

养基中 具有生长上的选择优势，在反复的继代培养中，非胚性细胞的群 体将会爱步增加，而胚性成分则逐渐减少。到了一定时期之后， 在培养物中已不再含有任何胚性细胞，这时若想再恢复它们的胚 胎发生能力就不可能了。然而，如果在培养物中存在少量胚性细 胞，只是由于处在支配地位的非胚性细胞的抑制作用，这些胚性 细胞的全能性无法表达，在这种情况下，通过改变培养基成分， 使之有选择地促进全能细胞的增殖，就应当有可能恢复该培养物 的形态发生潜力。