mTOR信号通路调控CD133阳性胶质瘤干细胞自我更新的分子机制

《中国神经肿瘤杂志》2010，8（2）：75-8175

论著··

mTOR信号通路调控CD133阳性胶质瘤干细胞

自我更新的分子机制

付

军1,2，刘晓梅1,2，陈忠平1,2

510060;2.中山大学肿瘤防治中心神经外科/神经肿瘤科，

510060）

广东广州

（1.华南肿瘤学国家重点实验室，广东广州

【摘要】背景与目的：mTOR（mammaliantargetofrapamycin）信号通路异常活化和高级别胶质瘤患者的预后不良相关。本研究探讨mTOR信号通路调控胶质瘤干细胞（GSCs）自我更新相关的分子机制。方法：采用CD133免疫磁珠分选CD133阳性胶质瘤干细胞。Westernblot检测mTOR信号通路组分p-S6K、p-S6和干细胞自我更新相关基因Bmi-1的表达水平；Rapamycin（RPA）阻断mTOR信号通路后，用肿瘤球形成实验评价干预mTOR信号通路对胶质瘤干细胞自我更新的影响；统计学处理采用SPSS11.0统计分析软件分析。结果：CD133阳性胶质瘤干细胞表达较高水平的mTOR信号通路组分p-S6K、p-S6和干细胞自我更新相关分子Bmi-1。通过rapamycin阻断mTOR信号通路，可诱导胶质瘤干细胞谱系分化，同时显著降低肿瘤球形成能力（P<0.05），而自噬抑制剂3-

MA处理不能逆转rapamycin的效应。结论：mTOR信号通路能够调控胶质瘤干细胞自我更新，阻断mTOR通路

下调胶质瘤干细胞自我更新潜能。

关键词：胶质瘤干细胞；mTOR信号通路；自我更新中图分类号:R739.41

文献标识码:A

文章编号:1726-8192（2010）02-0075-07

mTORSignalingPathwayRegulatesSelf-renewalofCD133

PositiveGliomaStemCells

JunFu1,2,Xiao-meiLiu1,2,Zhong-pingChen1,2

1.StateKeyLaboratoryofOncologyinSouthChina,Guangzhou510060,P.R.China;2.DepartmentofNeurosurgery/Neuro-oncology,CancerCenter,SunYat-senUniversity,Guangzhou510060,P.R.China

【ABSTRACT】BACKGROUND&OBJECTIVE:Activationofmammaliantargetofrapamycin(mTOR）has

beenassociatedtopoorprognosisofgliomapatients.ThisstudywasdesignedtoinvestigatetheregulatorymechanismsofmTORsignalingonself-renewalofgliomastemcells(GSCs).METHODS:CD133+GSCshavebeenisolatedbyusingCD133magneticbeadsfromhumanglioblastomaspecimensandgliomacelllineSKMG-4andwerepropagatedwithoutseruminvitro.Molecularmarkersforgliomastemcells(CD133,nestin,Sox-2,GFAPandTuJ1)weredetectedbyimmunofluorescentstaining.mTORsignalingpasswaywasinactivatedbyrapamycintreatment.Self-renewalwastestedbytumorsphereformationassay.ThephosphorylationstatusofmTORcomponentswasdeterminedbyWesternblotanalysis.AllstatisticalanalyseswereperformedusingtheSPSSsoftwarepackage,version11.0.RESULTS:Thelevelsofp-S6Kandp-S6,componentsofmTORsignaling,werehigherinCD133+GSCsthanmatchedCD133-cells.GSCfractionsalsoexpressedhighlevelsofBmi-1,akeyregulatorofneuralstemcellself-renewal.InhibitionofthemTORsignalingpathwaybyrapamycinresultedinareductionof.tumorsphereformation,whichisindenpendentfrom

autophagysince3-MAdidnotrevisetheeffectof

收稿日期：2010-01-16通讯作者：陈忠平

修回日期：2010-01-30

rapamycin.RapamycintreatmentalsoresultedindifferentiationoftheCD133+GSCs.CONCLUSION:DisruptionofmTORsignalscanimpairstemcellself-renewalandconcomitantlytriggerlineagedifferentiation.

KEYWORDS:Gliomastemcells;mTOR;Self-renewal

Correspondenceto:Zhong-pingChen

Tel:86-20-87343310

E-mail:chenzp57@http://doc.guandang.net

基金项目：国家自然科学基金（No.30772551）

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付军，等.mTOR信号通路调控CD133阳性胶质瘤干细胞自我更新的分子机制

目前，胶质瘤的总体治疗效果仍不理想，生存期短，复发率及死亡率高，特别是胶质母细胞瘤的平均生存时间还没有超过一年[1]。胶质瘤干细胞是胶质瘤的种子细胞，在肿瘤的发生、发展过程中起决定性作用，也是胶质瘤对放/化疗产生耐受以及复发的根源。针对胶质瘤干细胞自我更新的相关分子机制研究，将为开发有效治疗胶质瘤的药物提供切入点。

究采用分离的CD133阳性细胞作为胶质瘤干细胞，探讨mTOR信号通路调控胶质瘤干细胞自我更新相关分子机制。

1

1.1

材料与方法

试剂

mTOR（mammaliantargetofrapamycin）信号通

路整合生长因子、营养、能量和应激信号，调控蛋白质合成，细胞生长和增殖[2]。mTOR信号通路异常活化和高级别胶质瘤的发生以及预后不良相关[3]。目前，关于mTOR信号通路和胶质瘤干细胞自我更新的研究报道甚少。Zhou等[4]研究表明，mTOR/PTEN通路能够调控STAT3水平，从而影响乳腺癌干性细胞生存和干性维持。因此，mTOR信号通路可能和肿瘤干细胞自我更新有关。Bmi-1是目前研究较多的干细胞自我更新相关基因，该基因过表达常见于高级别胶质瘤[5]，且和胶质瘤预后不良相关[6,7]。

Rapamycin(RPA)和DAPI购自美国Sigma公司；抗体来源分别为：GFAP和Sox-2(Chemicon，美国)；Bmi-1(Abcam，美国);β-Actin,Nestin,S6K,p-S6K(Thr389),S6,p-S6(Ser240/244),p-AKT(Ser473),AKT,p-ERK1/2(Thr202/Tyr204),ERK1/2(CellSignaling，美国)。FITC和Cy3-荧光标记二抗(JacksonLaboratory，美国)。

1.2肿瘤干细胞的分选、培养和肿瘤球形成实验

本研究收集了3例中山大学肿瘤防治中心神经肿瘤/神经外科手术切除的原发性胶质母细胞瘤

新鲜肿瘤组织。样本的病理组织类型由肿瘤防治中心病理科确诊，肿瘤编号参考手术日期。同时选用神经肿瘤研究室保存的人脑胶质瘤细胞系SKMG-4裸鼠皮下移植肿瘤分选胶质瘤干细胞。患者的临床资料如表1。

Molofsky等[7]研究表明，Bmi-1基因特异性作用于神

经干细胞的自我更新而不是神经祖细胞增殖。本研

表1

病例号

肿瘤号

3例原发性胶质母细胞瘤患者资料

年龄/性别

手术日期

肿瘤部位右颞叶右顶叶左额叶

病理诊断

368233170027178026

081408160508

71/M54/F48/M

2007/08/142007/08/162008/05/08

GBMGBMGBM

采用CD133免疫磁珠分选技术(参考的羊抗鼠/兔二抗，37℃孵育30min；PBS液3×

MiniMACS人CD133细胞分选试剂盒说明书)从人脑胶质瘤组织和细胞系SKMG-4中分离脑胶质瘤

干细胞并进行体外无血清培养。干细胞培养基：

DMEM/F12+B27+EGF(20ng/mL)+bFGF(20ng/mL)。胶质瘤干细胞用0.25%胰酶+0.05%EDTA消化和400目金属不锈钢滤网，得胶质瘤干细胞单细胞悬液。每个实验组设置3个平行孔。计数后将1000个细胞接种于6cm培养皿中，培养7～10天

后计数肿瘤球的数目。

1.3免疫荧光染色

3min冲洗；封片，荧光显微镜观察染色结果。1.4Westernblot分析

收集无血清培养的肿瘤球细胞，加100μL细胞裂解液冰上裂解30min，4℃、12000r/min离心5min，取上清分装于0.5mL离心管中并置于-20℃保存待用。配制电泳凝胶（10％分离胶和4％浓缩胶）。样品在100℃，3min后冷却，900×g离心1min后上样，电泳后PVDF膜转膜。用脱脂牛奶封闭，一抗1∶500，室温，反应1h。PBS洗15min&# …… 此处隐藏：10888字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……