yeast-two-hybrid(中文版)(4)

如下，在适当的温度(通常为12-15℃)水浴8-14hr：

A．载体DNA(0.1-2ug/ul) 2.0ul

B．插入DNA(0.1-2ug/ul) 10.0ul

C．10×T4连接缓冲液 2.0ul

D．T4 DNA连接酶(1.0U／u1) 1.5-2.0ul

E．ddH2O 4.5-5.0ul

2. 单酶位点连接时，为避免自身环化可进行脱磷酸化反应，一般在限制性酶切反应结束时，

每20L11反应体系加入2.0ul 10×CIP缓冲液和1-1.5U CIP酶，37℃水浴30-60min，补加0.5M EDTA，pH8.0 1.0ul，75℃热变性5min灭活CIP，然后苯酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀回收酶解DNA片段，再进行连接反应。

3. 平端连接时，使用高浓度T4 DNA连接酶(5-10U/ul)，并加入15％终浓度的PEG8000。

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蛋白相互作用的验证

——pGBKT7/bait与pACT2小规模共转化酵母

一. 试剂：

1. 培养基：

YPDA液体培养基，(121°C，灭菌15min)

A． YPD (Clontech 公司) 15.0g

B． 0.2%Adenine 4.5ml

C. ddH2O ® 300.0 ml

SD/-Trp-Leu 固体培养基，(121°C，灭菌15min)

A. SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g

B. 10 ´ DO (-Leu-Trp) (Clontech 公司) 10.0 ml

C． ddH2O ® 100.0 ml 铺5块平板(90-100mm)

SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 固体培养基 (121°C，灭菌15min)

A. SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g

B. 10 ´ DO (-Leu-Trp-His-Ade) (Clontech 公司) 10.0 ml

C． ddH2O ® 100.0 ml

121°C，灭菌15min，冷却到50℃加入适量5M 3-AT（至终浓度15mM）与100ul X-α-GAL(20mg/ml),铺5块平板(90-100mm)

2. 其它贮备液

50% PEG 4000 (Sigma 公司 wt.=3,350)，用前抽滤或高压蒸汽灭菌;

100% DMSO (Sigma公司);

10 ´ TE: 0.1 M Tris-HCl (pH7.5)，10mM EDTA，高压蒸汽灭菌;

10 ´ LiAc: 1M LiAc用乙酸调pH7.5，高压蒸汽灭菌;

10 ´ Dropout/ -Trp-Leu 溶液: 3.2 g DO Supplement(-Leu-Trp) 溶于500ml ddH2O中; 10 ´ Dropout/ -Trp-Leu-His-Ade溶液: 3.0 g DO Supplement (-Trp-Leu-His-Ade)溶于500ml ddH2O中;

0.2%Adenine: 0.2g Adenine Hemisulfate Salt(Sigma公司)溶于100ml ddH2O中;

3-AT（5M）: 4.202g 3-AT溶于10ml ddH2O, 温水浴(<50℃)溶解,无菌滤器过滤后分装10个EP管,- 20℃保存;

X-α-GAL(20mg/ml): 1.25mg X-α-GAL)溶于1.25mlDMF中;

ddH2O: 高压蒸汽灭菌;

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二. 实验步骤：

1. 从YPDA平板上挑取生长1-3周、直径2-3 mm的AH109单克隆，接入1 ml YPDA

液体培养基中，振荡打散菌落，然后接入50 ml YPDA液体培养基中，30°C恒温，250rpm振荡培养过夜（16-18hr），至OD600>1.5;

2. 取适量过夜菌液接种于300 ml 新鲜的YPDA培养基，至OD600=0.2-0.3，30°C恒

温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.6 (约3hr);

3. 室温离心5000rpm ´ 5min，弃上清；加入25-50 ml ddH2O或TE 重悬洗涤酵母沉

淀细胞，离心弃上清，重复洗涤一次，沉淀用1.5 ml 1´TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞;

4. 准备下列试剂：

3´转化反应 10 ´ TE 10 ´ LiAc 50% PEG ddH2O

A. 1´TE/LiAc 1.50 ml 150 ul 150 ul / l.20 ml

B. PEG/LiAc 2.00 ml 200 ul 200 ul 1.6ml /

C. 1´TE 1.00 ml 100 ul / / 900 ul

5. 分装待转化的质粒DNA：

实验组 阳性对照 阴性对照 用量

1. pGBKT7-bait pGBKT7-53 pGBKT7-lam 0.2ug

2. pACT2-Y pGADT7-T pGADT7-T 0.1ug

3． Sperm DNA*(10 mg/ml) 0.1 mg

* Sperm DNA 新配制时水浴煮沸20分钟，立即插入冰浴，保存于-20°C。

6. 每管加入100ul用1´TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀;

7. 各加入600ul PEG/LiAc，剧烈振荡（提高转化效率），30°C恒温，200rpm 振荡培

养30min;

8. 各加入70ul DMSO，缓缓倒置混匀(不能振荡)，42°C水浴热休克15min，迅速插入

冰浴冷却1-2min;

9. 室温离心14,000rpm ´ 5sec，尽量弃尽上清，每管各取0.1 ml 1´TE重悬沉淀细胞，

涂布SD/ -Trp-Leu固体培养板，30°C倒置培养3天;

10. 挑取菌落点种于SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 平板，30°C倒置培养1-2天。

实验组菌落若无生长，说明蛋白间无相互作用；实验组菌落若生长且变蓝，说明蛋白有相互作用;