yeast-two-hybrid(中文版)

yeast-two-hybrid(中文版)

蛋白的酵母双杂交实验

——以钓饵蛋白筛选cDNA文库研究蛋白相互作用

第一部分 系统简介

1. 实验原理

蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA系统和Gal4系统两种。在LexA系统中，DNA结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD和AD分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS）结合但不能引起转录，单独的AD则不能与GAL UAS结合，只有当BD与AD分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD与AD才能与GAL UAS结合并且引起报道基因的转录。在BD与AD要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示：

Ampr

pGBKT7-bait pACT2-cDNA

图一：酵母双杂交系统工作原理

yeast-two-hybrid(中文版)

2．系统特点

同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。首先，融合体蛋白之间的相互作用是在真核酵母细胞内进行，蛋白质有可能保持天然的折叠状态，类似其在体内生理状态下的情况，这是其他离体生化检验方法所缺乏的，因此较之后者，它所证实的蛋白质间相互作用将更接近于在体的真实水平。其次，双杂交系统的敏感度即高，可以检测到在蛋白质之间结合常数低至1mmol/L左右的微弱作用。许多微弱或短暂的蛋白质之间的相互作用可以借助报道基因表达过程中的多级放大效应反映出来；融合蛋白基因在强启动子的作用下，处于较高的表达水平。第三，在筛选cDNA文库时，双杂交系统能够简捷地得到编码相互作用蛋白的基因序列，它只需构建质粒而不必准备抗体或纯化蛋白，省略了其它体外检测蛋白之间相互作用方法所必须的蛋白抽提、纯化等繁琐步骤。

需要指出的是，融合体蛋白必须转运至核内才能活化转录，因此对于胞外配体—受体作用以及需要核外修饰或受磷酸化等翻译后修饰过程介导的蛋白质间相互作用而言，该系统的应用受到一些限制。在进行文库筛选时，假阳性结果常常干扰实验的准确性，除某些文库编码的蛋白质本身含有转录活化成分外，细胞内的其它无关蛋白也可能有类似作用，因此双杂交系统检测的结果必须通过其它蛋白间相互作用的实验来进一步验证。

3．酵母双杂交GAL4系统筛选cDNA文库实验流程

yeast-two-hybrid(中文版)

4．GAL系统所用酵母菌株与载体

1). GAL系统所用酵母菌株

注：菌株AH109可利用所带的HIS3、ADE2、MEL1三个报道基进行筛库。

菌株Y187可利用所带的IacZ报道基因来验证两个已知蛋白间的相互作用。

菌株CG-1945可被用于用环己酰亚胺来分离BD-bait和AD-library质粒。

2). GAL系统所用各种质粒

yeast-two-hybrid(中文版)

第二部分 实验流程

构建于AD载体的cDNA文库的扩增

一．培养基：

LB液体培养基，121℃，15 lbf/ in2灭菌15min

A． bacto-Tryptone 10.0g

B． bacto-Yeast Extract 5.0g

C． NaCl 5.0g

D． 5N NaOH 调pH ® 7.0

E. ddH2O ® 1000.0 ml

* LB固体培养平板为含有1.8％琼脂（Agar）的LB培养基

LB/Amp培养基为含有Amp 100 ug/ml（高压后冷却到50℃加入）的LB培养基

二．实验步骤：

1. 自-70℃冰箱取出含有DNA文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻；

2. 用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释；

3. 取稀释菌液各10ul加入90ul LB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp

平板(φ90mm); 37℃倒置培养过夜或30℃培养24-36hr,计数平板上单克隆菌落数；

4. 确定待扩增的DNA文库滴度（cfu/ml）=克隆数´108(1:106 稀释)或克隆数´1010(1:108

稀释)；

5. 按照>2-4´104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp平板(φ150mm)，共100块；37℃倒

置培养过夜；

6. 在超净台上，将所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000ml

LB/ Amp培养液中，37℃振荡培养2-4hr;

7. 留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-70℃;

8. 其余培养菌液8000rpm´10min, 4℃，收集细菌；用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提

质粒DNA。

yeast-two-hybrid(中文版)

构建于AD载体的cDNA文库的纯化

一. 试剂：

质粒DNA提取缓冲液

名称

P1

P2

P3

QBT

QC

QF 缓冲液 悬浮缓冲液 裂解缓冲液 中和缓冲液 平衡缓冲液 洗涤缓冲液 洗脱缓冲液 配 方 50mM Tris-Cl,pH8.0; 10mM EDTA; 100ug/ml RNase A 200mM NaOH; 1%SDS 3.0M KAc,pH5.5 750mM NaCl; 50mM MOPS,pH7.0; 15%异丙醇; 0.15％TritonX-100 1.0M NaCl; 50mM MOPS,pH7.0; 15%异丙醇 1.25M NaCl; 50mM Tris-Cl, pH8.5; 15%异丙醇

二. 实验步骤：

1. 培养菌液离心6000 rpm´10min，4℃,每500ml的培养物的沉淀重悬于50ml P1缓冲

液;

2. 加入50m1 P2缓冲液，倒置4-6次混匀，室温孵育5min;

3. 加入4℃预冷的50ml P3缓冲液，快速倒置4-6次混匀，冰浴30min (其间再倒置混

匀4-6次);

4. 将上述混合液再倒置混匀，离心12000rpm´ 30min, 4℃，保留上清；

5. 上清再离心12000rpm´ 15min, 4℃，留上清；

6. 将上清液上样于经35m1QBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱；

7. 以100ml QC缓冲液洗涤层析柱2次；

8. 以35m1 QF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA；

9. 以0.7倍体积异丙醇沉淀DNA，离心12500 rpm ´ 30min，4℃，小心去除上清；

10. 以7m1 70％乙醇洗涤沉淀DNA，离心12500 rpm ´ 10min，4℃，小心去除上清；

11. 将沉淀的质粒DNA溶于5ml TE，pH8.0缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用2.5

倍体积无水乙醇；l/10体积3.0M NaAc，pH5.2，于-20℃静置过夜；

12. 离心12500rpm ´ 20min，4℃,去除上清，沉淀用70％乙醇洗涤，超净台风干；

13. 干燥的DNA溶于适量体积TE，定量，分装100-200ug/管(用于1次转化反应 …… 此处隐藏：3037字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……