yeast-two-hybrid(中文版)(3)

C.Sperm DNA(10mg/ml) 10ul 200ul 2.0ml

1´TE/LiAc重悬感受态细胞 1.5ml 1.0ml 8.0ml

酵母感受态细胞 100ul´20 1.0ml 8.0ml

加PEG/LiAc，剧烈振荡 0.6ml´20 6.0ml 60.0ml 加DMSO，轻柔混匀 70ul´20 700ul 7.0ml 室温离心后弃上清 14000rpm´5sec 2500rpm´5min 2500rpm´5min 1´TE重悬感受态细胞 0.1ml´20 6.0ml 10.0ml 铺固体选择培养基平板 φ90mm´20 φ150mm´50 φ150mm´50 5. 6. 7. 8. 9. 10.

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注：小规模转化用于：（1）检验DNA-BD/bait 有无自身激活报道基因的能力;

（2）观测 DNA-BD/bait对宿主的毒性作用;

（3）对照实验;

（4）筛库前先转入DNA-BD/bait;

大规模、库规模转化用于：转入文库质粒或同时转化两种质粒筛库;

转化子的筛选与库质粒纯化

一. 培养基：

SD/-Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL 固体培养基 (121°C，灭菌15min)

A. SD Agar Base (Clontech 公司) 4.67g

B. 10 ´ DO (-Leu-Trp-His-Ade) (Clontech 公司) 10.0 ml

C. ddH2O ® 100.0 ml

121°C，灭菌15min，冷却到50℃加入适量5M 3-AT（至终浓度15mM）与100ul X-α-GAL(20mg/ml),铺5块平板(90-100mm)

65%甘油-硫酸镁缓冲液

A. 甘油 65ml

B. Mg2SO4·2H2O 2.465g

C. 2.0M Tris·HCl 1.25ml

D. ddH2O ® 100.0ml

二. 实验步骤：

1. 选择菌落数30-300的滴度平板计算转化效率与克隆总数：

假设100ug库质粒转化时重悬菌液10ml, 以100ul菌液涂布的1:100的滴度板上菌

落数100，则：

转化效率：

克隆总数：

2. 筛库要求克隆总数超过文库克隆数（胎肝库为1.6´106克隆）的十倍；若克隆总数

低于106则需重新转化;

3. 将平板移至4°C冰箱，固化琼脂3-4小时;

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4. 超净台中，向每块平板滴加5ml 1´TE，用涂布棒刮下菌落，收集于50ml离心管;

5. 室温离心2500rpm´5min，弃上清。用无菌双蒸水反复洗涤3-5次;

6. 保存菌种：每管取0.5ml菌液与0.5ml 65%甘油 硫酸镁混匀，-70°C冻存;

7. 取适量菌液（使克隆总数达文库滴度的5-10倍），涂布SD/ -Trp-Leu-His-Ade筛选

平板，30°C倒置培养3-5天至菌落出现;

8. 挑取菌落点种到SD/ -Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL平板，30°C倒置温育，显兰

色的菌落即阳性候选克隆;

9. 阳性候选克隆分区划线接种于SD/ -Trp-Leu /X-α-GAL平板上，30°C倒置温育3

天，使同一酵母菌中几种库质粒分离;

10. 挑取再次显兰色菌落重复上一步;

11. 此次所得兰色菌落点种于SD/ -Trp-Leu-His-Ade/3-AT/X-α-GAL平板，30°C倒置温

育1-2天，显兰色的菌落即可用于质粒提取鉴定。

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酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定

—— 酵母质粒DNA的提取

一. 试剂与培养基：

SD/-Leu培养液，(121°C，灭菌15min)

A. SD Base (Clontech 公司) 2.67g

B. 10 ´ DO (-Leu-Trp) 10.0 ml

C. 20 ´Trp 5.0 ml

D. ddH2O ® 100.0 ml

酵母裂解液:2%Triton X-100; 1% SDS; 100mM NaCl; 10mM Tris,pH8.0; 1mM EDTA

A. 10% Triton X-100 20.0ml

B. 10%SDS 10.0ml

C. NaCl 0.58g

D. Tris 0.12g

E. EDTANa2·2H2O 0.12g

F. 1.0N HCl → pH8.0

G. ddH2O → 100.0ml

二. 实验步骤：

1. 挑取经过酵母营养缺陷平板筛选并分离的兰色酵母单菌落，接种于5.0ml SD/-Leu

液体培养基，30°C恒温，250rpm振荡培养1-2天，使丢失pGBKT7/bait 质粒;

2. 室温离心5000rpm×1min，弃上清;

3. 加入酵母裂解液200ul，振荡重悬菌团;

4. 加入玻璃珠(sigma)0.2g，苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）0.2ml, 涡流振荡5min;

5. -70℃保存过夜或液氮冻存10 min;

6. 室温复融，再振荡5 min;

7. 室温离心12000 rpm×10min，上清转移至新的1.5 ml离心管中，加入3MNaAc

（1/10V）20ul，无水乙醇（2.5V）500ul，-70℃冻存30-60min;

8. 离心12500 rpm×10min，4℃，弃上清；70%乙醇洗涤沉淀，于37℃烘箱或超净台

干燥DNA；以20-30ul无菌ddH2O重悬DNA，保存于-20℃。

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大肠杆菌感受态细胞的制备（电转化）

一．培养基：

SOB液体培养基，115℃，101b/in2灭菌15min

A. bacto-Tryptone 10.0g

B. bacto-Yeast Extract 2.5g

C. NaCl 0.25g

D. KCl 0.09g

E. MgCl2·6H2O 1.02g

F. ddH2O → 500.0ml

二. 实验步骤：

1． 挑取LB固体培养基上生长的E.coliKC8单菌落，接种于5ml LB液体培养基中，37℃恒

温，250 rpm振荡培养过夜;

2． 将2.5ml新鲜菌液接种于500mlSOB培养液中，37℃恒温，250 rpm振荡培养至

OD600=0.5-0.6（约2.5-3hr）;

3． 将培养菌液收集于离心管中，冰水浴15-20min;

4． 离心6000 rpm×10min，4℃，弃上清；以5ml预冷的无菌ddH2O重悬菌团，再加入500ml

预冷的无菌ddH2O洗涤沉淀细菌;

5． 重复上述步骤1次，以充分去除培养基中残余的盐离子成分;

6． 用40-50ml预冷的无菌10%甘油重悬沉淀细菌，转移至50ml无菌离心管中，离心6000

rpm×10min，4℃，弃上清；重复此步骤1次;

7． 以等体积（约1.5-2.0ml）预冷的无菌10%甘油重悬上述沉淀的感受态细胞，分装200ul/

管（5次转化反应），冻存于-70℃备用。

文库质粒DNA电转化大肠杆菌E.coliKC8

1． 冰浴条件下，取2ul待转化质粒DNA加入40ul感受态细胞中，混匀;

2． 加入间距0.1cm样品杯，电转化（1.8KV，25uF，200Ω）;

3． 迅速加入1ml新鲜LB培养液，混匀，转入1.5ml离心管，37℃恒温，250rpm振摇孵育

1h;

4． 离心2500rpm×5min，4℃，弃上清，保留100ul菌液涂布LB/Amp平板，37℃倒置温育。

yeast-two-hybrid(中文版)

碱裂解法小量制备细菌质粒DNA

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