过氧化氢酶动力学常数测定

实验项目二、过氧化氢酶的活力和动力学常数测定

姓 名： 赵家熙 指导教师： 谭志文 实验室： 6503 组员：①章恒炯 ② ③ 成绩： 第三部分：实验记录与分析 一、酶活力测定 （一）原始数据

1.样品原始质量：5.032g 2.标定数据：

（1）KMnO4质量数及配制：158 （2）Na2C2O4质量数：134 （3）标定数据：0.02mol/L

（4）KMnO4实际浓度：0.019mol/L 3.样品滴定数据

消耗高锰酸钾溶液（ml）：实验（1）0.65

实验（2）0.50 对照（1）1.45 对照（2）1.30

（二）结果计算

1．换算系数（1mL KMnO4溶液相当于多少mg H2O2）

1.7

2.样品酶活计算（每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示：mg H2O2/g?min）

(A?B)?VT?1.7FW?V1?t酶活(mgH2O2/g·min)=

酶活(mgH2O2/g·min)=0.218

（A-B）=0.8 VT=20.25 FW=5.032 V1=2.5ml t=10min

二、动力学常数的测定 （一）原始数据 编号 1 消耗的0.10 KMnO4（mL） 2 0.10 3 0.40 4 0.30 5 0.30

（二）求出各管反应前的底物浓度[S]0和反应速度V0 编号 1 [S]0 （mol/L） 0.005 2 0.0067 3 0.0082 4 0.0125 5 0.0250 0.0099 V0 （mmol/min） 0.0124 0.0126 0.0221 0.0471 （三）以1/V0对1/[S]0作图（用excel作图）

1/s 1/v

200 111.1

149.2 80.6

121.9 79.3

80 45.1

40 21.2

（四）求出Km（mol/L）和Vmax（mmol/min）

Km11?? vv[S]v如（三）中图 maxmaxy=0.5572x+1.5829 x=0时 y=1/Vmax y=0时 x=-1/Km

Km=0.35 Vmax=0.63 第四部分：课后研讨题

1.总结本实验操作过程的注意事项。

1酶的提取和存放一般在0-4℃下进行。

2每个三角瓶内的酶促反应时间要精确控制在5min。 3各反应瓶的滴定终点微红色为同一标准。

4使用前应检查滴定管是否渗漏，滴定过程中应该保证逐滴加入。

2.影响过氧化氢酶活力测定的因素有哪些?

1、温度，温度过高或者过低会降低过氧化氢酶的活性。 2、酸碱度，酸或碱浓度太高会使过氧化氢酶失活。

3.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?

R(Fe2+)+H2O2 = R(Fe3++OH－) R(Fe3+OH－)2+H2O2 = R(Fe2+)2+2H2O+O2

4.在反应速度的测定中，加入硫酸有哪些作用？

终止反应,为下一步的滴定提供酸的环境。

5.米氏方程中的Km有何实际应用？

米氏常数是酶促反应速度n为最大酶促反应速度值一半时的底物浓度。可用于判断反应级数；判断是否为不同种酶；判断酶的最适底物；确定酶活性测试时所需底物的浓度。

6.在什么条件下，酶的Km可以作为鉴定酶的一种手段，为什么？

当ν=Vmax/2时，Km=[S]。Km值是酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。 Km值对某一特定酶来说是个常数。一半根据酶的Km值来判断这些酶是否是完全相同的酶，或是催化同一反应的一类酶。 Km值越大，酶与底物亲和力越小；Km值越小，酶与底物亲和力越大。

7.测定酶活力为什么要在进程曲线的初速度时间范围内进行？

进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，说明酶的反应速度下降。反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强等原因所致。

8.过氧化氢酶的活力测定还有另外一种方法，即紫外吸收法，原理是H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使

反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活力。请你查阅资料设计一个应用该方法测定过氧化氢酶活力的实验。

实验概要

本实验用紫外吸收法测定了过氧化氢酶的活性。 主要试剂

0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）； 0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。 主要设备

紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴。 实验步骤

1. 酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。

2. 测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表顺序加入试剂。

表 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表 管 号 粗酶液(ml) pH7.8磷酸(ml) 蒸馏水(ml) S1 0.2 1.5 1.0 S2 0.2 1.5 1.0 S3 0.2 1.5 1.0 25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。

3. 结果计算：

以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。

过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=

式中 A240 = AS0－

AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值； AS1, AS2—样品管吸光值； Vt—粗酶提取液总体积（ml）； V1—测定用粗酶液体积（ml）； FW—样品鲜重（g）；

0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）； t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。 注意事项

凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。

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