圆二色光谱分析蛋白质构象的方法及研究进展

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第3 2卷20 04年 3月

分析化学 ( E X U X E)评述与进展 FN I A U HC ie e J u n lo ayi a e s y h n s o r a fAn lt l c Ch mit r

第 3期3 8—3 4 8 9

圆二色光谱分析蛋白质构象的方法及研究进展沈星灿梁宏， 何锡文王新省(南开大学化学系，天津 3 07 ) 00 1

(广西师范大学化学化工学院，生物无机研究所，桂林 5 10 ) 4 0 4

摘

要

介绍了远紫外圆二色光谱数据计算蛋白质二级结构，辨认蛋白质三级结构类型的原理、拟合方法、实

验技术。对近紫外圆二色作为光谱探针，研究蛋白质中芳香氨基酸残基、二硫键微环境的变化作了简单介绍。关键词圆二色，白质二级结构，白质三级结构，蛋蛋评述

1引

言

随着人们对生命科学的日益关注，分析化学的深入发展将越来越重视和加强生物分析。特别是人类基因测序工程完成后，因生物、医学上的需要，使与蛋白质的相关研究成为生物分析中的重要课题。 自 Kn e e& w采用 x射线技术，一首次揭示肌红蛋白的折叠结构以来，白质的研究从氨基酸残基序蛋列的测定，入到空间结构一深构象的确定。近年来，人们发现疯牛病、一氏病和震颤病等神经退行性克雅

疾病是由 Pi病蛋白所致， rn o而构象变化在 Pi病蛋白的致病因素中起着至关重要的作用[】 rn o 1。这使 . 2人们进一步认识到蛋白质的构象对其生理功能的巨大意义，要深入理解蛋白质的生物活性，就必须了解它的构象及其相关变化。目前，确定蛋白质构象最准确的方法是 x一射线晶体衍射，对结构复杂、但柔性的生物大分子蛋白质来说，得到所需的晶体结构较为困难。二维、多维核磁共振技术能测出溶液状态下较小蛋白质的构象，可是对分子量较大的蛋白质的计算处理非常复杂。相比之下，圆二色 ( i u r C cl r a d h i简称 C ) i rs com D光谱是研究稀溶液中蛋白质构象的一种快速、简单、较准确的方法。 16年，r n e最早用 C 9 9 Ge f l ei d D光谱数据估计了蛋白质的构象，关的研究方法陆续有报 J相道[。特别是近十几年来，远紫外圆二色 (a— VC )据分析蛋白质二级结构， 4 用 Fr D数

u不但在计算方法

和拟合程序上有了极大地发展¨ o, 3而且随着 x射线晶体衍射与核磁共振技术的提高， J一越来越多的蛋白质的精确构象得到测定， C为 D数据的拟合提供了更精确的数据库 。研究者还发现用 C卜 D光谱研究蛋白质三级结构具有独特优点，展了用远紫外 C发 D光谱辨认蛋白质三级结构的方法及相关程

序

;此外，近紫外圆二色( er VC ) N a— D作为一种灵敏的光谱探针， u可反映蛋白质中芳香氨基酸残】。本文就 C D光谱技术分析蛋白质构象的基本原理、验技术及其研究实

基、二硫键微环境的变化】 D光谱技术作为研究溶液状态下蛋白质或多肽构象的一种重要手段，卜卵。C 已受到研究者的广泛关注进展做一评述。

2蛋白质的圆二色性及其测量2 1蛋白质的圆二色性 .

蛋白质是由氨基酸通过肽键连接而成的具有特定结构的生物大分子。蛋白质一般有一级结构、二级结构、二级结构、超结构域、三级结构和四级结构几个结构层次。在蛋白质或多肽中，主要的光活性基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键。当平面圆偏振光通过这些光活性的生色

基团时，光活性中心对平面圆偏振光中的左、右圆偏振光的吸收不相同，产生的吸收差值，由于这种吸收差的存在，造成了偏振光矢量的振幅差，圆偏振光变成了椭圆偏振光，这就是蛋白质的圆二色性。圆二色性的大小常用摩尔消光系数差△ M~ m来度量， ( c )圆二色性也可用摩尔椭圆度[] 0来度量，它

与摩尔消光系数差之间的换算关系式为：20 -90 0 20 -7收稿；o 3 .8接受 2 o 21本文系国家自然科学基金( o 22 l 1、 N .0 6o )广西自 o然科学基金 (桂科青 0 30 2和高校优秀青年教师奖励计划资助项目 39 2 )

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第 3期

沈星灿等：圆二色光谱分析蛋白质构象的方法及研究进展

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通常近似为： [] 30 A 0= 30 8 () 2蛋白质的 c D光谱一般分为两个波长范围， 18— 5 m为远紫外区 c即 7 20n D光谱， 5 30n 20— 2 m为近紫外区 C D光谱。远紫外区 C D光谱反映肽键的圆二色性。在蛋白质或

多肽的规则二级结构中，肽键是高度有规律排列的，排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。因此，有不同二级结构的蛋具白质或多肽所产生 C D谱带的位置、吸收的强弱都不

相同。如图 l所示：一 O螺旋结构在靠近 12a t 9 m有正的谱带， 22和 28n在 2 0 m处表现出两个负的特一

征肩峰谱带； - 3折叠的 C D谱在 2 6n 1 m有一负谱带， 在 15 20n 8— 0 m有一正谱带； - 3转角在 26n 0 m附近有一正 C D谱带，而左手螺旋 P 2结构在相应的位置有负的 C D谱带。因此，根据所测得蛋白质或多肽的图 d -螺旋，‘ B折叠，‘ B转角及P结构多肽的C 2 D

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信息。尽管，处于不对称微环境的芳香氨基酸残基、 ( )螺旋 ( l )折 (嘣；;角 o .: (叠 . ) v ;) B (; s h二硫键也具有圆二色性，但它们的 c D信号出现在 (.; ) ( i 0L酸液的硼氨，p - 1m)( P o。/醋溶中聚 3 t v 2 . I酸 0.

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:: 三

20— 2 m近紫外区， 5 30n这些信息可以作为光谱探针

l rni .ml tad。 ya e 1 oLc cc) l n / ai i pi 0 e

研究它们不对称微环境的扰动，对肽键在远紫外区的 C D信号并不造成干扰。 22 C测量的样品准备及条件选择 . D由于 C D是一种定量的、灵敏的光谱技术。所以，样品的准备及测量条件的选择对分析计算蛋白质构象的准确性至关重要，尤其是一些蛋白质的构象信息出现在低 15n 9 m的真空紫外区，对试剂和缓冲体系的要求更高。测试用的蛋白质样品中应避免含有光吸收的杂质，冲剂和溶剂在配制溶液前最好缓做单独的检查，明性极好的磷酸盐可用作为缓冲体系。透 蛋白质最佳浓度的选择和测定，决定 C D数据计算二级结构的准确性。C D光谱的测量一般在蛋白 质含量相对低( .l 02gL的稀溶液中进行， OO一 ./ )溶液最大的吸收不超过 2。稀溶液可减少蛋白质分子间的聚集。但如果太稀，则导致蛋白质过多地吸附在容器壁上，影响实验的准确性。确定蛋白的精确质

浓度是计算样品的二级结构的关键，一般蛋白质在 20n 8 m附近的消光系数可用来计算浓

度，但此处吸收信号与蛋白质的构象有关，该方法的误差一般可达到 5¨%。更精确的方法有：定量氨基酸分析；用缩二脲方法测量多肽骨架浓度或测氮元素的浓度；也可以在完全变性条件下测芳香氨基酸残基的吸收，来确定蛋白质的准确浓度。 真空紫外 C D谱的测试要求很高，光路必须使用大通量、高纯度 N洗涤，般选用光路径为 一 00 l'的圆形石英测试池， .5一 L ln l r以减少光吸收。此外，为减少光谱的失真，响应波长应小于 C D峰半高宽的 1 1(/0通常蛋白质是 1 m) 5a。采用慢的扫描速度和较长的响应时间可以提高 C D的信噪比。必要

时，用数据平滑算法和傅里叶变换对谱图进行平滑处理，可得到较高质量的光谱图。

3 C D数据拟合计算蛋白质二级结构31 C . D数据拟合计算蛋白质二级结构的基本原理及常用方法

由于 22 28n 2和 0 m是 o螺旋结构的特征峰， t一早期就曾利用这两处的摩尔椭圆度[猫或[ 来 ]]简单估计 o螺旋的分量L5: t …… 此处隐藏：17507字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……