GB 4789.3-2010 食品微生物学检验 大肠菌群计数

中华人民共和国国家标准

GB 4789.3—2010

食品安全国家标准

食品微生物学检验 大肠菌群计数

National food safety standard

Food microbiological examination: Enumeration of coliforms

中华人民共和国卫生部 发布

前 言

本标准代替GB/T 4789.3-2008《食品卫生微生物学检验 大肠菌群计数》。 本标准与GB/T 4789.3-2008相比，主要修改如下： ——修改了标准的中英文名称；

——“第二法 大肠菌群平板计数法”的平板菌落数的选择范围修改为“15 CFU～150 CFU”；——删除了“第三法 大肠菌群PetrifilmTM 测试片法”。 本标准的附录A、附录B为规范性附录。 本标准所代替标准的历次版本发布情况为：

——GB 4789.3-1984、GB 4789.3-1994、GB /T 4789.3-2003、GB /T 4789.3-2008。

食品安全国家标准

食品微生物学检验 大肠菌群计数

1 范围

本标准规定了食品中大肠菌群（Coliforms）计数的方法。 本标准适用于食品中大肠菌群的计数。 2 术语和定义

2.1 大肠菌群coliforms

在一定培养条件下能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。 2.2 最可能数most probable number，MPN

基于泊松分布的一种间接计数方法。 3 设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下： 3.1 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。 3.2 冰箱：2 ℃～5 ℃。 3.3 恒温水浴箱：46 ±1 ℃℃。 3.4 天平：感量0.1 g。 3.5 均质器。 3.6 振荡器。

3.7 无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。3.8 无菌锥形瓶：容量500 mL。 3.9 无菌培养皿：直径90 mm。

3.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 3.11 菌落计数器。 4 培养基和试剂

4.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose，LST）肉汤：见附录A中A.1。

4.2 煌绿乳糖胆盐（Brilliant Green Lactose Bile，BGLB）肉汤：见附录A中A.2。 4.3 结晶紫中性红胆盐琼脂（Violet Red Bile Agar，VRBA）：见附录A中A.3。 4.4 磷酸盐缓冲液：见附录A中A.4。 4.5 无菌生理盐水：见附录A中A.5。 4.6 无菌1 mol/L NaOH：见附录A中A.6。 4.7 无菌1 mol/L HCl：见附录A中A.7。

第一法 大肠菌群MPN计数法

5 检验程序

大肠菌群MPN计数的检验程序见图1。

图1 大肠菌群MPN计数法检验程序 6 操作步骤 6.1 样品的稀释

6.1.1 固体和半固体样品：称取25 g样品,放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内, 8000 r/min～10000 r/min均质1 min～2 min,或放入盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min～2 min，制成1:10的样品匀液。

6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

6.1.3 样品匀液的pH值应在6.5～7.5之间，必要时分别用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl调节。

6.1.4 用1 mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓缓注入9 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1 mL无菌吸管反复吹打，使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

6.1.5 根据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1 mL无菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15 min。 6.2 初发酵试验

每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1mL（如接种量超过1 mL，则用双料LST肉汤），36 ℃±1 ℃培养24 h±2 h，观察倒管内是否有气泡产生，24 h±2 h产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至48 h±2 h，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。 6.3 复发酵试验

用接种环从产气的LST肉汤管中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（BGLB）管中，36 ℃±1 ℃培养48 h±2 h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 6.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告

按6.3确证的大肠菌群LST阳性管数，检索MPN表（见附录B），报告每g（mL）样品中大肠菌群的MPN值。

第二法 大肠菌群平板计数法

7 检验程序

大肠菌群平板计数法的检验程序见图2。

图2 大肠菌群平板计数法检验程序

8 操作步骤

8.1 样品的稀释

按6.1进行。 8.2 平板计数

8.2.1 选取2个～3个适宜的连续稀释度, 每个稀释度接种2个无菌平皿，每皿1 mL。同时取1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照。

8.2.2 及时将15 mL～20 mL冷至46 ℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加3 mL～4 mLVRBA覆盖平板表层。翻转平板，置于36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h。 8.3 平板菌落数的选择

选取菌落数在15 CFU～150 CFU之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为0.5 mm或更大。 8.4 证实试验

从VRBA平板上挑取10个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于BGLB肉汤管内，36 ℃±1 ℃培养24 h～48 h，观察产气情况。凡BGLB肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。 8.5 大肠菌群平板计数的报告

经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以8.3中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每g（mL）样品中大肠菌群数。例：10-4样品稀释液1 mL，在VRBA平板上有100个典型和可疑菌落，挑取其中10个接种BGLB肉汤管，证实有6个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：100×6/10×104/g（mL）=6.0×105 CFU/g（mL）。

附录A

（规范性附录） 培养基和试剂

A.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤

A.1.1 成分

胰蛋白胨或胰酪胨 20.0 g 氯化钠 5.0 g 乳糖 5.0 g 磷酸氢二钾（K2HPO4） 2.75 g 磷酸二氢钾（KH2PO4） 2.75 g 月桂基硫酸钠 0.1 g 蒸馏水 1 000 mL

pH 6.8±0.2 A.1.2 制法

将上述成分溶解于蒸馏水中，调节pH。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL。121 ℃高压灭菌15 min。

A.2 煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤

A.2.1 成分

蛋白胨 10.0 g 乳糖 10.0 g 牛胆粉（oxgall或oxbile）溶液 200 mL 0.1%煌绿水溶液 13.3 mL 蒸馏水 800 mL pH 7.2±0.1 A.2.2 制法

将蛋白胨、乳糖溶于约500 mL蒸馏水中，加入牛胆粉溶液200 mL（将20.0 g脱水牛胆粉溶于200 mL蒸馏水中，调节pH至7.0～7.5），用蒸馏水稀释到975 mL，调节pH，再加入0.1%煌绿 …… 此处隐藏：2947字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……