Spectrum Living Image 40软件操作流程

Spectrum Living Image 40软件操作流程

Spectrum Living Image 4.0软件操作流程

本流程主要介绍Spectrum的Living Image 4.0软件的应用，包括参数介绍、生物发光、荧光二维及三维成像的图像获取及数据分析

1、 控制面板参数介绍

关键参数，决定灵敏度

整个图像的获取过程都通过该控制面板操作，其中曝光时间、bin值及光圈大小是最为关键的参数，直接影响图像获取的质量。 曝光时间（exposure time）

曝光时间决定了信号强度，曝光时间越长，信号强度越高，实验时应根据实际情况设定适当的曝光时间，初次实验若不知道合适曝光时间，可选择Auto曝光，仪器会自动检测一个合适的曝光时间以成像，当信号较弱时可适当增加曝光时间以获取较佳信号。注：生物发光成像的曝光时间为分钟（min）级别，而荧光成像的曝光时间为秒（sec）级别，实验时应注意参数设定。

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Bin值（Binning）

Bin值表述的是将多少像素作为感光单元，bin值越大则表示应用更多的像素作为一个感光单元，因此，bin值越大则灵敏度越高，而分辨率会有所牺牲，当信号强度较弱时可适当增加bin值以获取信号。

光圈大小（f/stop）

光圈大小决定了光的透过量，光圈越大，穿过光圈到达CCD的光越多，面板中的数字为F/stop中的分母数字，因此，数字越小代表光圈孔径越大，透过的光越多，当信号较弱时可通过增大光圈（减小数字）而增强信号探测能力。

Large Binning (16)

Medium Binning (8)

Small Binning (4)

f/1

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视野范围（Filed of View）

视野范围用于调节观测的视野大小，共有A/B/C/D四档可选，分别代表不同大小的视野范围，实验时根据一次观察小鼠个数选择合适的视野范围进行成像。

FOV A: 4.0 cm FOV B: 6.5 cmFOV C: 12.5 cm FOV D: 21.5 cm

成像聚焦（Focus）

成像的聚焦包含自动聚焦和手动聚焦功能，在用小鼠进行成像时，一般默认成像对象的高度为1.5cm，仪器会自动完成聚焦，在用其他对象进行成像时（如大鼠），可调节Subject height参数，设定合适的聚焦高度，也可在Focus下拉选项中选择

聚焦设定

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2、 生物发光二维成像的图像获取

勾选Luminescent、Photograph及overlay选项，设置好曝光时间（生物发光曝光时间为分钟级别）、bin值、光圈大小及视野范围等参数（软件有默认参数，可按照默认参数成像，若效果不佳，则再调整各参数，调整的次序按照曝光时间＞bin值＞光圈大小顺序调整），Emission Filter选项设置为open，Photograph选项的参数一般情况无需调整，所有参数设定完毕后点击Acquire按钮即可开始成像。

成像完成后，在得到结果图的同时会弹出实验信息记录对话框（下图右框），可输入相关实验信息以记录实验情况，一次可最多同时选择5个选项进行记录，记录完成后，记录的相关信息会反映在结果图中，点击结果图中的info按钮即可看见。

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3、 荧光二维成像的图像获取

荧光二维成像与生物发光二维成像的操作流程基本类似，只是多了一些参数的设定，另外，对于需要扣除背景的成像，需应用到荧光光谱分离技术，该技术的操作流程将在第4节中详细说明，本节主要介绍获取单张荧光二维图片的操作流程。荧光二维成像可选择使用反射照明或透射照明进行荧光激发，当信号在皮下等较浅部位时可选择反射照明成像，而当信号位于肝脏等较深部位时可选择透射照明（Transillumination）进行成像。

对于反射照明成像具体步骤如下：勾选Fluorescent、Photograph及overlay选项，设置好曝光时间（荧光曝光时间为秒级别）、bin值、光圈大小及视野范围等参数（软件有默认参数，可按照默认参数成像，若效果不佳，则再调整各参数，调整的次序按照曝光时间＞bin值＞光圈大小顺序调整），根据标记所用探针的激发光及发射光波长，选择合适的激发光（Excitation）及发射光（Emission）滤片，Photograph选项的参数一般情况无需调整，所有参数设定完毕后点击Acquire按钮即可开始成像。

选择荧光成像模式

透射照明

选择滤光片

对于透射照明成像，其他步骤与反射照明成像相同，只是需要选择Transillumination选项，点击Setup按钮进行透射点的选择，对于单张图片的获取只需选择一个点。

绿色代表点已选上

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4、 荧光光谱分离

Spectral Unmixing是一种将背景荧光信号与荧光探针信号分离的光谱分离方法。其应用主要包括两方面：1、将特异性荧光信号从组织自发荧光中分离出来；2、将不同的探针信号分开，用于多种探针同时成像。这里以反射荧光成像为例，详细介绍应用Living Image 4.0进行Spectral Unmixing的具体步骤。更详细的说明请参见UserGuide。

点击Sequence Setup按钮，进行序列图的成像设定，可点击Add按钮手动添加并设定多图成像参数，但这样比较复杂，目前的软件都已具有Imaging Wizard功能，该功能相当于一个参数设定向导，可引导使用者进行包括unmixing在内的多种功能的完成（如下图）：

点击Imaging Wizard 按钮，进入设置向导

选择Fluorescence选项，按照向导指示完成unmixing设定操作（如下）：

选择探针类型，如果所用探针下拉列表中包含则直接选择该探

针，如果列表中没有则在下拉列表最下方有Input EX/EM,可自行

生物发光成像 输入探针的激发光和发射光波长

荧光成像

3种波长扫描获

取方式，通常使

用发射光扫描

方式(Emission

Scan)，即固定

激发光波长，选

择不同发射光

波长成像

选择Spectrum unmixing

图，蓝色虚框圈选的即为将扫描的波段

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其他参数设定与控制面板中参数设定相同 Subject

点击Next 点击Acquire Sequence按钮，将开始序列图的获取，结果如下

获取的原始序 列图，将基于这 些序列图进行

光谱分离

在图像分析工具栏中点击展开Spectral

选择需要进行光谱分离的区域，可

Unmixing工具条，选择进行光谱分离

通过滑动条改变区域大小，紫色表

的波长，点击Start Unmixing按钮

示已选定区域，通常使用软件默认选择的紫色区域即可

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选择需要进行

光谱分离的成

分

2

显示光谱分离 光信号

显示光谱分离结果，左上图为分离得到的背景光信号，右上图为分离得到的特异性探针信号，左下图为用两种假色表示的合成图，发表文章需要的为右上图的探针信号图，后续的定性定量分析均选择此图进行，双击此图后便可开始后续分析，分析操作将在下列章节介绍

点击左图中的Spectra按钮，可显示线性光谱图，详细显示背景光谱 …… 此处隐藏：4869字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……