宝生物工程(大连)有限公司 One Step PrimeScript® miRN(2)

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*1 反应体系可按需求相应放大，20 μl反应体系可最多使用5 μg的Total RNA。

2. Real Time PCR反应。

（TaKaRa 以下是使用本制品进行反转录反应后，选择SYBR Premix Ex TaqTM II（Perfect Real Time）Code: DRR081）进行Real Time PCR反应的操作方法。

◆应用Thermal Cycler Dice® Real Time System扩增仪的操作方法

请按照Thermal Cycler Dice® Real Time System（TaKaRa Code：TP800）的使用说明书要求进行实

验操作。

① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

范围内调整引物浓度。

反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。 *3 建议反应液体积为25 μl。 ② 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。退火/延伸时间可在20～30秒范围内进行调整，推荐使用30秒的条件。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

两步法PCR扩增标准程序： Stage 1：预变性 Repeat：1 95℃ 10秒

Stage 2：PCR反应 Repeat：40 95℃ 5秒

60℃ 20秒

Stage 3：Dissociation

◆特别提示：

本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

③ 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

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*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM*2 建议在25 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。

◆应用ABI PRISM® 7000/7700/7900HT，7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法请按照Applied Biosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。

① 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

范围内调整引物浓度。

*2 建议在20 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为模板。反转

录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。

*3 ROX Reference Dye II（50×）比ROX Reference Dye（50×）浓度低，使用7500

Real-Time PCR System 和7500 Fast Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye II（50×）。与使用ROX Reference Dye（50×）相比，校正后的荧光信号值高，但解析结果完全相同。使用ABI PRISM7000/7700/7900HT及7300 Real-Time PCR System时，请使用ROX Reference Dye（50×）。

*4 96孔板、Single-Tube、8联Tube采用50 μl反应体系，384孔板、96-well Fast Thermal

Cycling plate采用20 μl反应体系。

② 进行Real Time PCR反应。

建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行

三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。 < ABI PRISM 7000/7700/7900HT，7300/7500 Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序： Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40 95℃ 5秒

60℃ 30～34秒*

Dissociation Stage

* 使用7700和7900HT时请设定在30秒。 使用7000和7300时请设定在31秒。

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使用7500时请设定在34秒。

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0 μM

< 7500 Fast Real-Time PCR System >

两步法PCR扩增标准程序： Stage 1：预变性

Reps：1

95℃ 30秒

Stage 2：PCR反应

Reps：40 95℃ 3秒

60℃ 30秒

Dissociation Stage

◆特别提示：

本制品中使用的TaKaRa Ex Taq HS是利用抗Taq抗体的Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

◆应用LightCycler® Real Time PCR扩增仪的操作方法

请按照LightCycler®（Roche Diagnostics公司）的使用说明书要求进行实验操作。 ①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。

1.0 μM范围内调整引物浓度。

*2 建议在20 μl反应液中使用相当于10 pg～100 ng Total RNA量的cDNA为

模板。反转录反应液的加入量不能超过PCR反应液总体积的10%。 ② 进行Real Time PCR反应。

PCR反应用毛细管请用离心机轻轻离心后放入LightCycler中进行Real Time PCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序，如果该程序得不到良好的实验结果时，再进行PCR条件的优化。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。

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③ 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

*1 通常引物终浓度为0.4 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～

两步法PCR扩增标准程序：

Stage 1：预变性

95℃

30秒

20℃/秒

1 Cycle

Stage 2：PCR反应

95℃ 60℃

5秒 20秒

20℃/秒 20℃/秒

40 Cycles

Stage 3：融解曲线分析

◆特别提示：

本制品中使用的TaKaRa Ex Taq

HS是利用抗Taq

抗体的

Hot Start用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型Hot Start用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。

③ 实验结果分析。

反应结束后确认Real Time PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。

95℃ 65℃ 95℃

0秒 15秒 0秒

20℃/秒 20℃/秒 0.1℃/秒

● 实验条件的选择

如果按照推荐的两步法条件进行反应，反应性能不好时，请按照下面的方法进行引物和PCR反应条件的研讨。实验条件选择时，请从反应特异性与扩增效率两方面进行综合考虑。要求能同时满足这两个条件的反应体系，并可以在较大浓度范围内进行很好的定量。 ○反应特异性高的实验体系应具备以下条件：

No Template Control 时不产生引物二聚体等非特异性扩增。 不产生目的片段以外的扩增。 ○扩增效率高的实验体系应具备 …… 此处隐藏：3373字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……