宝生物工程(大连)有限公司 One Step PrimeScript® miRN

TaKaRa Code：D350A

One Step PrimeScript®

miRNA cDNA Synthesis Kit (Perfect Real Time)

（20次量）

宝生物工程(大连)有限公司

目 录

内 容

页 码

● 制品说明 ● 制品内容 ● 保 存

● 需要准备的其他试剂 ● 试剂盒原理 ● 特 长 ● RNA样品制备 ● 操作注意 ● 操作方法

1．Poly(A)加尾反应和反转录反应 2．Real Time PCR反应

◆应用Thermal Cycler Dice Real Time System扩增仪的操作方法 ◆应用ABI PRISM 7000/7700/7900 HT，

7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System的操作方法 ◆应用LightCycler Real Time PCR扩增仪的操作方法 ● 实验条件的选择 ● 实验例 ● 引物设计说明 ● 问 答

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● 制品说明

本制品中含有合成Poly(A)多聚尾和合成cDNA所需的全部试剂，可以将样品中的miRNA（起始样品可以是Total RNA、small RNA fragments等任何包含miRNA的样品）经过一次反应合成为1st Strand cDNA（样品中的mRNA、snoRNA等其它形式的RNA也会同时被反转录成cDNA）。本试剂盒经过特别的优化，将Poly(A)加尾反应和cDNA合成反应同步进行，在1小时内即可完成miRNA 1st Strand cDNA合成，且产物（TaKaRa Code：无需进行纯化，可直接使用PCR反应试剂SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）

DRR081）进行Real Time PCR定量检测，从而准确简便地对miRNA（或mRNA、snoRNA等其它RNA分子）进行表达量分析。由于本试剂盒对反应样品进行的Poly(A)加尾以及cDNA合成不具有特异性，所以经过一次反转录得到的产物可以用于多种miRNA以及mRNA、snoRNA等的定量分析。

本制品可以从10 pg~5 μg Total RNA反转录合成miRNAs、mRNAs和snoRNA等的1st Strand cDNA，再通过Real Time PCR反应，可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线，对靶基因进行准确定量、检测，重复性好，可信度高。

● 制品内容（20 μl反应×20次）

1. 2×miRNA Reaction Buffer Mix（for Real Time）*1 Enzyme Mix 2. miRNA PrimeScript® RT

3. 0.1% BSA 4. Uni-miR qPCR Primer（10 μM） 5. RNase free dH2O 6. Easy Dilution（for Real Time PCR）*2

*1 含有dNTP Mixture、Mg2+和反转录用的Universal Adaptor Primer。

200 μl 40 μl 40 μl 200 μl 1 ml×2 1 ml

*2 制作标准曲线时梯度稀释DNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或模板RNA如果用水或TE

稀释时，由于受Microtube的吸附作用等原因的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。EASY Dilution也可以单独购买（TaKaRa Code：D9160）。

EASY Dilution请与本公司Real Time PCR试剂组合使用，对于其他公司同类制品的适用性本公司尚未进行确认。

● 保 存： -20℃。 ● 需要准备的其他试剂

SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）（TaKaRa Code：DRR081）

● 试剂盒原理

1.

反转录反应

试剂盒中的miRNA PrimeScript® RT Enzyme Mix中包含Poly(A) Polymerase和反转录酶PrimeScript® RTase，两种酶经过优化达到最佳比例。试剂盒中的2×miRNA Reaction Buffer Mix中包含反应所需的dNTP Mixture、Mg2+和反转录用的Universal Adaptor Primer等，其组份也是根据miRNA PrimeScript® RT Enzyme Mix进行了优化调整，使上述两种酶都可以达到最佳活力。

如原理图1所示，与mRNA不同，miRNA不具有Poly(A)结构，但在本试剂盒的反转录反应中，可以同时对样品中的miRNA以及其它small noncoding RNA进行Poly(A)加尾反应，然后利用Universal Adaptor Primer（含有oligo-dT）将经过Poly(A)加尾的RNA以及mRNA进行反转录反应得到cDNA，并引入了Uni-miR qPCR Primer的结合位点，利用这一位置可以对样品中任何cDNA进行定量PCR反应。

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2. 定量PCR反应

反转录结束后，采用SYBR Green I嵌合荧光法对合成的cDNA进行定量分析。Real Time PCR扩增反应可以采用如图2显示的SYBR Green I嵌合荧光法，即在反应体系中加入与双链DNA结合便可发出荧光的荧光染料SYBR Green I，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。客户可以使用试剂盒中提供的Uni-miR qPCR Primer及自行设计的miRNA Specific Forward Primer对miRNA进行定量解析，且使用一次合成的cDNA就可以同时对多个miRNA或者snoRNA、mRNA等分子进行检测。

图1. miRNA定量原理图

图2. 嵌合荧光法原理图

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● 特 长

1. Poly(A)加尾反应和反转录反应在同一Tube中同时进行，在较短的时间内高效合成miRNA Real Time

PCR用的cDNA，可以快速、准确地对miRNA进行表达分析，是进行miRNA Real Time RT-PCR反应的最佳试剂。

2. 使用一次合成的cDNA就可以同时对多个miRNA或者snoRNA、mRNA等分子进行检测。

3. 制品中附加了标准曲线制作用稀释液EASY Dilution（for Real Time PCR），将Total RNA或cDNA稀

释至低浓度也能够进行准确稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。

● RNA样品制备

本制品是将RNA反转录成cDNA的专用试剂。RNA的纯度会影响cDNA的合成量，而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。

【使用器具】

尽量使用一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在使用前按下列（1）或者（2）方法进行处理。 （1）干热灭菌（180℃，60 min）

（2）用0.1% DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。然后在120℃下高压灭菌30分钟

以除去残留的DEPC。

RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其它实验。

【试剂配制】

用于RNA实验的试剂，需使用干热灭菌（180℃，60 min）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水需用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。

RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。

【制备方法】

使用如RNAiso Plus（TaKaRa Code: D9108）等传统的RNA纯化方法即可获得满足于本试剂盒反应的miRNA（只需少量的miRNA便可进行RT-PCR反应），或者可以使用其它任何可以保障small RNA在提取过程中不会丢失的方法。为了提高反应的灵敏度，也可以使用其它small RNA富集、纯化等方法。

【Total RNA中混有基因组DNA的对策】

提取的Total RNA中常常混有基因组DNA，而基因组DNA可以直接作为P …… 此处隐藏：3289字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……