外生长的影响及相关实验技术的研究(3)

目前对ＭＳＣ的鉴定，一般采用两种方法：免疫表型鉴定、分化潜能鉴定。目前尚未发现ＭＳＣ独特的表面抗原，ＭＳＣ表达间质细胞、

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内皮细胞、上皮细胞和肌肉细胞的一些标志分子，而不表达造血细胞的标志。已经报道的一些表面抗原包括Ｓ仃０１、ＣＤｌ３、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７ｌ、ＣＤ９０、ＣＤｌ０６以及ＣＤｌ２４等【２７１。根据多种表面抗原阳性和造血谱系抗原阴性的检测结果，而鉴定ＭＳＣ。对认定同源或同质的细胞群进行诱导分化培养，如能向成骨、成软骨和成脂谱系多向分化，可逆推其为间充质干细胞，即为分化潜能鉴定。虽然这种鉴定是后验性的，但由于未找到识别ＭＳＣ的独特标记分子，认为是目前鉴定ＭＳＣ最佳标准。

在正常生理条件下，机体内大多数ＭＳＣ并不增殖，但是在体外补充适宜血清的培养液中，ＭＳＣ能迅速增殖，并在多次传代中保持未分化状态。许多因素可以影响骨髓ＭＳＣ在体外培养条件下的增殖和分化。细胞的种植密度、动物种系、个体的年龄和身体状况、骨髓的取样部位以及分离细胞的技术等因素也都影响它们的生长。然而，这些影响因素中最重要的影响因素是血清。血清的品质、浓度、批次都对骨髓ＭＳＣ的影响较大。Ｈａｙｎｅｓｗ嘣ｈ【２８１等的研究表明，筛选合适批号的胎牛血清有助于ＭＳＣ的贴壁、扩增以及多谱系潜能的维持。Ｌ锄ｏｎｄ等【２９】报道，人骨髓间充质干细胞在体外不同批次血清的培养条件下细胞抑制生长率相差６倍。血清中细胞因子的量及种类的差异是其对骨髓ＭＳＣ作用不同的主要原因。

骨髓ＭＳＣ增殖和分化受到多种细胞因子和生长因子的调节，这些因子在ＭＳＣ上存在相应的受体，现已检测到的有ＩＬ．１Ｒ、ＩＬ．３Ｒ、ＩＬ．４Ｒ、ＩＬ．６Ｒ、ＩＬ．７Ｒ、ＬＩＦＲ、ＳＣＦＲ、Ｇ．ＣＳＦＲ、ＩＮＦ—ＹＲ、ＴＮＦ－０【Ｒ、

四种人参三醇组皂蒈对小鼠骨髓ＭＳＣ体外生长的影响及相关实验技术的研究

ＴＧＦ．ｐｌＲ、ＴＧＦ．ｐ１Ｒ、ｂＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ等多种细胞因子和生长因子受体。Ｙｏｏｎ掣３伽报道在血清剥夺的情况下，同时在培养体系中加入经骨髓细胞培养获得的无血清条件培养液，人或小鼠骨髓基质成纤维细胞集落均能够形成；但同时做抗体中和实验，加入抗ＰＤＧＦ、抗ＴＧＦ．ｐ、抗ｂＦＧＦ和抗ＥＧＦ四种抗体后，能特异地抑制集落的形成，这提示骨髓基质成纤维细胞前体细胞增殖起始的激活至少需要ＰＤＧＦ、ＴＧＦ．ｐ、ｂＦＧＦ和ＥＧＦ四种因子的参与。

由于骨髓ＭＳＣ具有高增殖、多向分化潜力，易获取、易培养，便于自体移植、无免疫反应等特点，不仅使它们在干细胞生物学基础研究中受到青睐，也使它们成为用于细胞和基因治疗的诱人候选者，尤其对它们作为在组织工程的“种子＂细胞的应用前景，人们有着浓厚的兴趣。然而，在ＭＳＣ能被成功地利用前，它们的许多基本生物学问题和操作性问题还有待弄清和解决，其中的关键课题之一是在阐明其增殖和分化调控机制。

３．本研究的目的和意义

本研究的目的是通过小鼠骨髓ＭＳＣ的原代培养和传代培养，在培养体系中加入四种含不同糖基数的人参三醇组皂苷Ｒｅ、Ｒｇｌ、Ｒｈｌ、ｐｐｔ，观察对体外培养条件下小鼠骨髓ＭＳＣ及其传代细胞生长的影响，初步探索其可能的作用机制，并进一步明确人参皂苷脱糖基化与其药理活性的关系，对人参皂苷的药理研究、临床用药和新药开发具有理论意义和应用价值。

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１．１材料与方法

１．１．１实验动物

昆明种小鼠，雌雄不拘，３～４周龄，体重１８土１．２９，为ＩＩ级动物。由中南大学湘雅医学院实验动物学部提供。

１．１．２主要试剂及仪器、耗材

①主要试剂

胎牛血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｎｌｍ，ＦＢＳ）：天津ＴＢＤ生物工程公司产品，５６℃灭活３０ｍｉｎ，分装后一２０℃贮存。

ＤＭＥＭ培养液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｎｌｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓｍｅｄｉｕｍ）：ＤＭＥＭ粉（低糖，Ｓｉ鄹ｎａ公司产品）用约Ｏ．５Ｌ三蒸水溶解，培养基加入ＮａＨＣ０３３．７９，再加三蒸水至近１Ｌ，用Ｏ．１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ调ｐＨ至７．Ｏ，三蒸水定容至１Ｌ，正压过滤除菌，４℃保存，使用期２个月以内。

磷酸盐生理盐水缓冲液（ＰＢＳ）：取ＮａＣｌ

Ｎａ２ＨＰ０４ Ｈ２０１．５６９，ＫＨ２Ｐ０４８．ＯＯｇ，ＫＣｌＯ．２０９，Ｌ，０．２０９，用三蒸水溶解，定容至１高压灭菌４０ｍｉｎ，４℃保存备用。

胰蛋白酶溶液：取Ｏ．２５９胰蛋白酶溶于近１００１ｎＬＰＢＳ缓冲液，充分溶解，用Ｏ．１ｍｏｌ／ＬＮａＯＨ调ｐＨ至８．Ｏ，ＰＢＳ缓冲液定容至１００ｍＬ，正压过滤除菌。

四甲基偶氮唑盐（３一（４，５－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏｚ０１）一２，５一ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅ一仃讹ｏｌｉ啪ｂｒｏ耐ｄｅ，ＭＴＴ）：ＳｉｇＩｎａ公司产品，用磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，Ｏ．０１ｍ０１／Ｌ，ｐＨ７．４）配成５ｍ的ｎＬ的ＭＴＴ溶液，正压过滤除菌，分装，４℃避光保存，一星期之内使用。

四种人参三醇组皂苷对小鼠骨髓ＭｓＣ体外生长的影响及相关实验技术的研究人参皂苷工作液：准确称取一定量的ＧＳ－Ｒｅ、一Ｒ９１、一Ｉ洫ｌ、ｐｐｔ，根据所称取的人参皂苷重量，用相应体积的ＤＭＥＭ液配制成的２５０ｐｍｏｌ／Ｌ的人参皂苷溶液，即为工作液。配制时，用乙醇助溶，先将人参皂苷用一定体积的无水乙醇溶解，再将乙醇溶解的人参皂苷逐滴加入ＤＭＥＭ，工作液中乙醇的浓度１．２５％（体积分数）。配制时室温在２５℃左右，磁力搅拌２０分钟。将工作液过滤除菌，２５℃下贮存备用。

成骨分化诱导液：用含ｌＯ％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液配制，含１０。‘７ｍ０１／Ｌ的地塞米松（储存液１ｍｍｏｌ／Ｌ，无水乙醇配制）、ｌＯｍｍ０１／Ｌ的ｐ一磷酸甘油和５０ｍｇ／Ｌ的抗坏血酸。

成脂分化诱导液：用含１０％ＦＢＳ的ＤＭＥＭ培养液配制，含１０“ｇ／Ｌ的胰岛素（储存液ｌＯＯ“ｇ／Ｌ，生理盐水配制）、１邮∞１／Ｌ的地塞米松（储存液ｌ加ｍｏｌ／Ｌ，无水乙醇配制）、Ｏ．５ｍｍｏｌ／Ｌ的１．甲基．３．异丁基黄嘌呤（储存液５００ｍｍｏｌ／Ｌ，ＤＭＳＯ配制）以及１００岬ｏｌ／Ｌ吲哚美辛（储存液１００ｍｍｏｌ／Ｌ，丙酮配制）。

瑞氏－吉姆萨（ＷＨｇｈｔｅ．Ｇｉｅｍｓａ）染色液：瑞氏粉和吉姆萨粉均为上海试剂总厂第三分厂产品。Ｏ．２９瑞氏粉溶于１２０ｍＬ纯甲醇中制得瑞氏染液，Ｏ．８９吉姆萨粉溶于５０ｍＬ甲醇制得吉姆萨染液。将瑞氏染液与吉姆萨染液按５：ｌ的体积比混合并过滤，即为瑞氏一吉姆萨染液。使用时先加少量染液染色５～８ｎｌｉｎ，再加等量ＰＢＳ混合继续染色５～ｌＯｍｉｎ。

茜素红．嘶ｓ—ＨＣｌ染液：ｌｇ三羟甲基氨基甲烷（而ｓ，鼎国生物技

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术公司）加入ｌＯＯｍＬ三蒸水中，用滴管逐滴加入ＨＣｌ至ＰＨ为８．３左右，配好后加入０．１ｇ茜素红粉（Ａｌｉｚ撕ｎＲｅｄＳ，上海生工生物工程有限公司产品），即为Ｏ．１％茜素红．嘶ｓ．ＨＣｌ染液，用小口塞瓶密封避光保存备用。

油红Ｏ．乙醇染液：将Ｏ．５９油红０粉（国药集团化学试剂有限公司产品）加入１００ｒｎＬ７０％乙醇中，混合后间隔摇动多次，待２４ｈ后形成饱和溶液即可，用小口塞瓶密封至室温中保存备 …… 此处隐藏：2023字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……