乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)操作说明

乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒 (PCR-荧光探针法)操作说明【产品名称】通用名称：乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR-荧光探针法)英文名称：Diagnostic Kit for Quantification of Hepatitis B Virus DNA (PCR-Fluorescence Probing)【包装规格】 32人份/盒【预期用途】乙型肝炎病毒是乙型病毒性肝炎的病原体，具有较强传染性，传播途径复杂，流行面广，发病率高等特点，可导致急慢性乙型肝炎，淤胆型肝炎，严重的可导致急性肝衰竭，临床上主要表现为肝功能损害，部分患者可有黄疸。隐形感染较为常见。目前临床上常用的 HBV检测方法主要有酶免疫法、化学发光法检测 HBV标志物和核酸检测 HBV DNA方法。本试剂盒定量检测人血清和血浆样本中的乙型肝炎病毒 DNA,主要是通过对乙肝患者血中 HBV DNA基线水平和变化情况的监测，用于评估抗病毒治疗的应答和治疗效果监测。检测结果仅供临床参考，不能作为患者病情单独的评价指标，必须结合临床表现和其他实验室检测指标对患者病情进行评价，亦不能作为血液筛查 HBV病毒的筛查试剂使用。【检验原理】本品基于 TaqMan探针实时荧光 PCR技术。在 PCR反应过程中，同时利用 Taq酶的 5’→3’聚合酶活性和核酸外切酶活性，使得 TaqMan探针降解，荧光报告基团和淬灭基团分离使得荧光信号发射， FAM荧光检测乙型肝炎病毒， JOE/RED 610 nm波长通道检测内参。本品使用外源性内参，可以监控和避免由于样本中的 PCR抑制物或操作不当引起的“假阴性”结果。【主要组成成份】每个反应组份名称装量主要成份中的用量 1 2 3 4 5 6 7 8 9核酸提取液 A核酸提取液 B内参 MgCl2 PCR缓冲液A Taq酶 HBV引物探针阴性对照阳性血清对照 3×1.1ml/管 2×1ml/管 160μl/管 450μl/管 480μl/管 160μl/管 320μl/管 100μl/管 100μl/管 100μl 50μl 3μl 13μl 15μl 5μl 10μl - - - 7μl 7μl 7μl 7μl 7μl聚乙二醇、 NaCl NaOH、SDS、Tween-20、 Chelex-100合成病毒 MgCl2 Buffer、dNTPs Taq酶、UNG酶 HBV引物和探针，内参引物和探针 HBV阴性血清 HBV阳性血清 HBV阳性血清寡核苷酸片段寡核苷酸片段寡核苷酸片段寡核苷酸片段寡核苷酸片段【储存条件及有效期】-20℃保存12个月。探针若单独储存，应注意避光。【适用仪器】本品适用于 AB 7300/7500/Mx3000P/LightCycler 480/SLAN实时荧光定量 PCR仪。【样本要求】用一次性的针筒抽取病人静脉血 1ml,置于灭菌的一次性试管中室温自然凝固或 800~1600g离心 20分钟，取分离出的血清 0.2ml左右送检。血清标本 2~8℃可放置 72小时，-70℃可长期保存，标本不宜反复冻融。【检验方法】 1.试剂配制按样本数(样本数

=待检血清样本数+血清对照品 3个+定量校准品 5个)n配制反应液：取 PCR缓冲液 A n×15μl、HBV引物探针 n×10μl、Taq酶 n×5μl、MgCl2 n×13μl至于一离心管中混匀；低速离

心数秒，按 43μl/管分装到反应管中。 2.内参配制将 n×3μl内参(单通道仪器不加内参)及 n×50μl核酸提取液 B至于一新离心管中混匀备用(混合后避免反复冻融使用，使用前混匀 5秒钟)。 3.样本、对照品的处理样本处理：取 100μl待检血清样本(冻存血清使用前在室温融解，振荡混匀 10秒钟)分别加入 100μl核酸提取液 A,振荡混匀 10秒种，12 000rpm离心 10分钟，弃上清；分别加入 50μl核酸提取液 B与内参的混合液至沉淀中(使用前一定要充分混匀，将颗粒和液体一起加入沉淀中，其中颗粒量应在 15%以内),振荡混匀 10秒钟， 100℃保温 10分钟， 12 000rpm离心 2分钟。处理后的样品应在 1小时内使用，或在-20℃~-80℃最长保存 1个月(不宜反复冻融)。血清对照品处理：按照血清标本处理方法处理试剂盒内阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性对照。(冻存血清对照品使用前在室温融解，振荡混匀 10秒钟)。定量校准品处理：定量校准品无需处理，在样本加样前直接将定量校准品 1号至 5号振荡混匀 10秒钟，低速离心数秒后加样。 4.样本加样将样品处理上清液(冻存样品使用前室温充分融化，振荡混匀数秒，12,000rpm离心 2分钟)、阳性血清对照、弱阳性血清对照、阴性对照以及定量校准品各 7μl分别加入反应管中，低速离心数秒，取出置定量 PCR仪上。 5.仪器扩增程序 1、ABI7300/7500/Mx3000P/SLAN双通道仪器：反应管先在 50℃反应 2分钟，然后 94℃保温 5分钟，再按 94℃10秒→60℃45秒循环 40次。60℃采集 FAM、JOE荧光通道的信号。 2、LightCycler 480仪器：反应管先在 50℃反应 2分钟，然后 94℃保温 5分钟，再按 94℃10秒→60℃45秒循环 40次。 60℃采集 FAM、RED 610荧光通道的信号。 3、单通道仪器：反应管先在 50℃反应 2分钟，然后 94℃保温 5分钟，再按 94℃10秒→60℃45秒循环 40次，60℃采集 FAM荧光通道信号。 6.质量控制试剂盒中提供定量校准品五个，阴性对照，阳性血清对照和弱阳性血清对照各一个。如试剂质量完好并操作正确，阳性血清对照、弱阳性血清对照、定量校准品应表现为阳性结果，阴性对照应表现为阴性结果，阳性血清对照定量值为 5.0±2.5×10 IU/ml,弱阳性血清定量值为 5.0±2.5×10 IU/ml。如超过范围则实验无效，应检查仪器、试剂、扩增条件等方面的误差。在每次检测中都应设置阴阳性对照品。 7.结果判断仪器程序运行完

成后，按软件要求进行结果保存，输入HBV定量校准品的量值，选择自动分析模式，软件将自动给出标准曲线并计算各样本的HBV DNA含量Q(IU/ml)。5 3

1弱阳性血清对照 100μl/管 0 1定量校准品 1号 15μl/管 7 1 (7.5×10 IU/ml) 1定量校准品 2号 15μl/管 6 2 (7.5×10 IU/ml) 1定量校准品 3号 15μl/管 5 3 (7.5×10 IU/ml) 1定量校准品 4号 15μl/管 4 4 (7.5×10 IU/ml) 1定量校准品 5号 15μl/管 3 5 (7.5×10 IU/ml)注：不同批号试剂盒中各组份不能互换。自备实验耗材：适用规格的离心管、微量移液器等。

定性实验：样本的结果判断： FAM Ct值 Ct<38 38≤Ct<40 Ct≥40 Ct≥40内参 Ct值 Ct<36 Ct<36 Ct<36 Ct≥36阳性检测灰区，建议重复检测 2次，如检测结果至少 1次仍为 FAM通道 Ct<40判断为阳性阴性存在 PCR抑制物，或操作不当，应对样本重新提取扩增复检，或者重新采集样本复检结果判断

【注意事项】 1. 2.开始检测前请仔细阅读本说明全文。核酸提取一定要在样本采集后 48小时内尽快进行，否则 DNA会发生明显降解。不能尽快进行的，应参照【样本要求】保存。 3. 4. 5. 6. 7. 8.实验中所用器具均应经过灭菌处理。使用本品时，应遵循临床基因扩增实验室的技术要求进行操作。加样时应使样本完全落入反应液中，不应有样本粘附于管壁上，加样后应尽快盖紧管盖。样本处理等步骤须在生物安全柜或其他防护设施中进行。实验室人员必须经过专业培训。实验过程应分区进行(试剂准备区、样本制备区、扩增和产物分析区),实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区个阶段用品不得交叉使用；各区间人员流动及空气流向应有严格要求，最大限度避免交叉污染。 9. 10.实验用消耗品(如离心管、吸头等)应有合理的清洁和质检程序，避免污染或扩增反应抑制物造成假阴性结果。本品仅用于体外诊断。

注：1、灰区的标本，需要重复 2次，如检测结果至少 1次 Ct<40判断为阳性。否则判断为阴性。 2、该次检测有效时，应检查每个样本内参通道的 Ct值，Ct值的有效范围为 23-36,同时呈现明显的 S型扩增曲线。定量实验：当 5个定量校准品的定量标准曲线的相关系数& …… 此处隐藏：3576字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……