细胞生物学实验教案(1) - 图文(6)

9、 10、

蒸馏水洗片刻

1%亮绿复染数秒钟（注意: 复染时间切忌过长，以免染色过深，影响对DNA的观察）

（二）对照

省略步骤3、4，其余同实验组 【实验结果】

细胞核中的DNA呈紫红色反应，它不但反应出DNA存在的部位及其分布情况，而且还可从颜色反应的深浅，来判断DNA的相对含量。细胞质被亮绿复染成绿色，核仁通常为绿色。 【注意事项】 1. 对照的制做

进行Feulgen反应时, 一般要做一对照切片以便验证反应结果。对照切片应不经水解直接放在schiff剂内。但需要注意的是，对照切片在schiff试剂中最多不要超过1 h (0.5 h即可)，时间过长，试剂本身的酸性也会使DNA水解，从而出现假阳性反应。 2. 水解时间

Feulgen反应通常用稀酸进行水解，但水解的时间一定要适当。如水解时间不够, 反应就会变弱；如水解时间过长。或水解地过于剧烈，则脱氧核糖也易掉下来，反应也会减弱。适当的水解时间一般为8~12min。但是水解时间长短也要视标本的类型(如厚薄等)、固定剂的性质以及酸的浓度而定。 3、Schiff试剂的作用

Feulgen反应成功与否的一个非常关键的因素，就是schiff试剂的质量。有一大类试剂均称为碱性品红，它们实际上是由几种产品分别组成的。因此只能选用注明“DNA染色反应用”的碱性品红才行。此外，Schiff试剂的配制方法也可影响DNA的染色反应。 【实验报告】

1、绘图表示Feulgen反应的染色结果 2、总结Feulgen反应染色结果的影响因素。

Feulgen方法应注意的几个问题： 1. 对照切片的制做

实验七 细胞骨架的光学显微镜观察

【实验目的】

掌握植物细胞骨架的光镜标本制作方法。 【实验原理】

细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网络结构，按组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维。它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用。

本实验用普通光镜观察到细胞骨架，是因为骨架纤维成束分布、结构经染色后，有夸大作用。由于细胞经TritonX-100抽提后剩下的主要是细胞骨架成分，使得显现更清晰。

光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1% Triton X-100处理细胞，能溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而细胞骨架系统的蛋白质却不被破坏显得更清晰，M-缓冲液洗涤细胞，可以提高细胞骨架的稳定性，戊二醛固定能较好地保存细胞骨架成分，经考马斯亮蓝R250染色后，可使细胞骨架蛋白着色，而胞质背景着色弱，有利细胞骨架纤维显示。

由于有些细胞骨架纤维在该实验条件下不够稳定，例如微管；还有些类型的纤维太细，在光学显微镜下无法分辨，因此我们看到的主要是微丝组成的张力纤维，直径约40nm左右。张力纤维形态长而直，常常与细胞的长轴平行并贯穿细胞全长。

考马斯亮蓝R250是一种普通的蛋白质染料，它可以使各种细胞骨架蛋白质着色，并非特异地显示微丝。 染色时用的M-缓冲液，其中咪唑是缓冲剂，EGTA和EDTA螯合Ca2+离子，溶液中并提供Mg2+离子，在此低钙条件下，骨架纤维保持聚合状态并且较为舒张。 【实验用品】

1、 实验材料：新鲜洋葱鳞茎

2、 实验器材：普通光学显微镜，小烧杯，滴管，试剂瓶．载玻片，盖玻片，镊子、吸水纸，擦镜纸 3、 试剂

1） M缓冲液（pH 7.2）各成分终浓度为： 50mmol/L咪唑(MW:68.08), 50mmol/L KCl(MW:74.55),

0.5mmol/L MgCl2·6H2O(MW:203.30), 1mmol/L EGTA(MW:380.36), 0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24), 1mmol/L DTT(MW:154.3) 2） 6mmol/L PBS磷酸缓冲液 （pH 6.5）:

KH2PO4 : Na2HPO4·2H2O = 7:3 (见附录3 查磷酸缓冲液的配置) 3） 0.9% 生理盐水

4） 1% Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于 M-缓冲液

5） 3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL ,PBS 88mL 6） 0.2% 考马斯亮蓝R250染液 200mL: 考马斯亮蓝R250 0.2g, 甲醇 46.5mL, 冰乙酸 7mL, 蒸馏水46.5 mL 各种试剂成分的作用：

1、Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非离子去垢剂，适当浓度的Triton X-100，可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存。

2、M－缓冲液 和磷酸缓冲液作用：维持细胞的渗透压

3、EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2＋，主要是高浓度的Ca2＋可使微管解聚，因此加入EGTA来降低Ca2＋的浓度 。 4、戊二醛作用：良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态 5、考马斯亮兰作用：非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色） 【实验步骤】 …… 此处隐藏：236字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……