细胞生物学实验教案(1) - 图文

实验一 特殊光学显微镜的结构与使用

【实验安排】 3学时 教师讲解演示，学生操作 【目的要求】

1、掌握暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的特殊部件； 2、掌握暗视野、相差和荧光显微镜的工作原理和使用方法； 3、熟悉暗视野显微镜、相差显微镜和荧光显微镜的基本结构。 【实验用品】特殊显微镜、酵母、牙垢微生物、菠菜、离心机、匀浆机 【实验内容】

1、特殊光学显微镜特殊部件的构造及调节

2、特殊光学显微镜的使用及注意事项 一、暗视野显微镜： 【实验原理及使用】

１、特殊部件：暗视野聚光器——使光源的中央光束被阻挡．不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。

暗视野显微镜工作原理示意图

2、用途：暗视野显微镜常用来观察未染色的透明样品。这些样品因为具有和周围环境相似的折射率，不易在一般明视野之下看的清楚，于是利用暗视野提高样品本身与背景之间的对比。这种显微镜能见到小至4～200nm的微粒子，只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。 3、使用方法：

（1）从聚光器座架上卸下明视场聚光器，换装暗视场聚光器，安装到位并固紧。

（2）把被检样品的玻片标本置于载物台上，需用油浸的暗视场聚光器，要在聚光器上透镜与载片间滴加香柏油，使

之密接。

（3）聚光器光轴的调中。聚光器的光轴要与显微镜的光轴位于同一轴线上。其方法是，用低倍物镜对样品聚焦，随

之用聚光器升降螺旋上下调节聚光器位置，当在暗视场中清晰地窥见一光环或圆形光点时，停止升降聚光器，用聚光器调中杆推动聚光器，使视场中的光环或光点，调至视场中心位置。

（4）调节聚光器焦点，使之位于被校样品处，转动聚光器升降螺旋，使视场中光环调成一最小的圆形光点，此刻即

为聚光器的焦点恰于样品处。 （5）更换需用的高倍物镜进行镜检观察。 4、注意事项：

（1）聚光器与物镜的数值孔径应合理匹配，物镜的数值孔径必须小于聚光器的数值孔径；否则会因物镜孔径角大于暗视场聚光器所形成的照明光束中心暗区的角度，致使部分照明光线射入物镜，破坏或降低了暗视场的照明。 （2）使用高数值孔径的油浸暗视场聚光器时，在聚光器与载片之间要滴加香柏油进行油浸，使两者密接。否则，照明光线于聚光器的上透镜表面进行全反射，照明光线照射不到被检样品，呈现不出暗视场照明的效果。

（3）载片厚度要适宜，照明光束经暗视场聚光器后，产生空心照明光锥，即中心为暗区，而反射光的焦点在聚光器上透镜表面之上很短的距离，因此，载玻片的适宜厚度应在0.8一1.2mm。

（4）载玻片和盖片应清洁无伤痕，否则照明光线会于其处发生漫反射而影响暗视场的照明。

（5）照明光源的照明强度要高。因暗视场照明是通过反射光照亮被检样品，若照明强度过弱照明样品的反射光强度不够，会影响观察效果，目前多应用高功率的溴钨灯作为照明光源以提高其照明强度。 二、相差显微镜：

1、原理：在显微镜下镜检时，视场内的样品只有在反射光的波长(颜色)和振幅(亮度)与周围介质有变化时，方能窥见被检样品。活的样品多为无色透明，照明光线通过这种物体时，透过或反射光的波长和振幅都不发生改变，所以用普通光学显微镜难以辨清活体的结构。必须借助于固定和染色等理化方法，使样品和背景的反射或透射光在波长和振幅上发生变化．即在颜色和亮度上有所差异，以供识别。

相差方法法应用于生物学的主要价值，在于它能对透明的活体进行直接观察，无需采用使细胞致死的固定和染色的方法。染色给活体以有害的影响，甚于失真。因此才使相差法显得异常重要。

相差是指同—光线经过折射率不同的介质其相位发生变化并产生的差异。相位是指在某—时间上光的波动所达到的位置。

一般由于被检物体（如不染色的细胞）所能产生的相差的差别太小，我们的眼睛是很难分辨这种差别的。只有当变相差为振幅差(明暗之差)之后，才能被分辨。

用肉眼看不到的相差．只要利用衍射和干涉现象．把相差变为明暗的振幅差，就可能看到。

相差显微镜就是利用被检物的光程之差进行镜检的。相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，在普通光学显微镜中增加了二个部件；在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜的后焦面加了一个相板，从而使看不到的相位差变成以明暗表示的振幅差。因此，可以用来观察无色透明活细胞中的细节。

为了达到相差效应，在相差显微镜的物镜中，装有由光学玻璃制成的相板，在圆形相板的平面上．有一圈与周围(里外)相板厚度不同的或凸或凹的圆环。相板分两部分；

（1）共轭面：通常为环状，是通过直射光的部分。其环是凸起的，也可能是凹陷的。 (2)补偿面(comPIemQtagy are3)：共轭面内外两侧部分，是通过衍射光的部分。

在相板的共扼面或补偿面上，涂有改变光波相位或吸收光线的物质。当光线通过时，使光波的相位或振幅改变．从而达到不同的目的与观察效果。利用相板把光波相位推迟，振幅改变。相板的作用，除推迟直射光和衍射光的相位之外，还有吸收光，从而使亮度改变的作用。物镜的后焦点位于透镜中间而相板位于物镜的后焦面上，所以，相板也安装在透镜中间。在后焦面上装有种类不同的相板的物镜称为相差物镜。

2、相差显微镜特殊附件：相差物镜、带环状光阑的转盘聚光器、合轴调中望远镜、绿色滤色镜。

（1）相差物镜： 相差物镜是显微镜特有重要装置。相位板涂有氟化镁，可将直射光或衍射光相位推迟1/4λ。 A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。

明反差或负反差：是指在相差显微镜的视场中，物像亮度大于背景亮度的现象。在被检物体的折射率大于媒质时，直射光被相板的共轭面上涂有改变相位和吸收光线的物质)推迟1／4波长，同时吸收80％一90％，振幅变小，致使仅由直射光照射的背景变暗。通过补偿面的衍射光没有变化，由于直射光推迟l／4波长，两者(直射光与衍射光)有完全相同的相位，合成波P等于直射光s与衍射光D之合，即P＝s十D，故振幅加大。物像是这两种波的合成波造成，即物像等于P。所以比只有直射光照射的背景亮得多。

B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，结构比周围介质更加变暗，形成暗反差（或称正反差）。

暗反差或正反差是指在相差显微镜的视场中，背景亮度大于物像亮度的现象。与明反差相反，把通过补偿面(因为在相板的补偿面上涂有改变光波相位的物质)的衍射光推迟1／4波长，使衍射光与直射光的相位相差1／2波长，同时，直射光在共轭面(上涂吸光物质)被部分吸收。由于两者在像点相互干涉的结果，使合成波(P＝s—D)振幅变小，被检物像的影像比背景显著变暗。

根据上述原理所制成的显微镜便是相差显微镜，聚光镜下面设有环状光阑．物镜后焦面装有相板。

（2）带环状光阑的转盘聚光器：位于镜台之下。普通聚光器的所在位置上由聚光镜和环状光阑构成。环状光阑位于聚光镜之下，是一种特殊的光阑装置，由大小不同的环状通光孔构成，不同规格的通光孔——环状光阑装配在一个可旋转的转盘上，按需要调转使用。环状光阐的环宽与直径各不相 …… 此处隐藏：3602字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……