核酸分子杂交技术概述

核酸分子杂交技术概述

第一节 核酸的分子结构

一、核酸的化学组成

组成核酸的元素有C、H、O、N、P等，其中N含量约为15%～16%，磷含量为9%～10%。由于核酸分子中的磷含量比较恒定，因此，核酸定量测定的经典方法，是以测定磷含量代表核酸量。

核酸经水解可得到多核苷核，因此核苷酸是核酸的基本单位，核酸就是由很多单核苷酸聚合形成的多核苷酸，核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可进一步水解，产生戊糖和含氮碱。因此，核酸是由含氮碱、戊糖及磷酸三种成分组成。

含氮碱（简称碱基）：核酸中的含氮碱简称碱基，是嘌呤碱（purine）与嘧啶碱（pyrimidine）的衍生物。RNA和DNA含有的共同碱基成分是腺嘌呤（adenine,A）、鸟嘌呤（guanine,G）和胞嘧啶（cytosine, C）。二者的区别是RNA含有尿嘧啶（uracil,U），而DNA含有胸腺嘧啶（thymine,T）。嘌呤和嘧啶都有酮-烯醇式互变异构现象，一般生理pH条件下呈酮式。它们的结构如下：

有些核酸中含有修饰碱基（或稀有碱基），这些碱基大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化（methylation）或进行其它的化学修饰而形成的衍生物。例如有些DNA分子中含有5-甲基胞嘧啶（m5C），5-羟甲基胞嘧啶（hm5C）。某些RNA分子中含有1-甲基腺嘌呤（m1A）、2，2-二甲基鸟嘌呤（m22G）和5，6-二氢尿嘧啶（DHU）等。

嘌呤碱和嘧啶碱一般多不易溶于水，对250～280nm波长的紫外光有较强的吸收，但对260nm光波的吸收能力最大。由于碱基是核酸的基本组成成分，因此，所有的核酸（包括DNA和RNA）其共同特点是对260nm处的紫外光有最大的吸收值。

核酸分子中碱基的克分子数与磷的克原子数相等，所以可根据核酸溶液中的磷含量及紫外光的吸收值来测定核酸量。一般以每升核酸溶液中含1g磷原子为标准来计算核酸的吸光率，这称为克原子磷吸光率或克原子磷消光系数[ε（p）],ε(p)的计算式为：

ε（p）=A/Cl

A为吸光度（光密度），1为比色杯内径，通常为1.0cm；C为每升核酸溶液中磷的克原子数。 C= 每升溶液中磷重（wg）/30.98 ε(p)=30.98A/wl

一般DNA的ε（p）=6000～8000;RNA为7000～10000

现将DNA和RNA的化学组成归纳如表18-1：

表18-1

二、核酸的一级结构

核酸又称多核苷酸，组成DNA的脱氧核糖核苷酸主要为四种，即dAMP、dGMP、dCMP及dTMP；组成RNA的核糖核苷酸主要有AMP、GMP、CMP及UMP四种。对两种核酸的组成可简写如下： DNA=（碱基-脱氧核糖-磷酸）n；RNA=（碱基-核糖-磷酸）n

核酸中核苷酸的连接方式为：一个核苷核C-3’上羟基与下一个核苷核酸C-5’连接在磷酸羟基脱水缩合成酯键，称酯键称3’5’磷酸二酯键，若干个核苷酸间依3’5’磷酸二酯键连接成长链的大分子即为核酸。此长链称多核苷酸链，在链的一核苷酸，其C-5’连接的磷酸只一个酯键，称此核苷酸为链的5’磷酸未端或5’。链的另一端核苷酸上C-3’上羟基是自由的，对此核苷酸称为3’羟基末端或3’端，链内的核苷酸在C-5’上磷酸已形成二酯键，C-3’上羟基也已参与二酯键的形成，故称核苷酸残基。

核酸的一级结构乃指其核苷酸链中核苷酸的排列顺序，由于核酸中核苷酸彼此之间的差别乃在于碱基部分，故核酸的一级结构即指核酸分子中碱基的排列顺序。

对核酸一级结构的描述为：将5’磷酸末端书于左侧，中间部分为核苷酸残基，3’羟基末端书于右侧。通常用竖线表示核糖，碱基标于竖线上端，竖线间有含P的斜线，代表3’,5’磷酸二酯键。此表示法及简化式如下：

三、核酸的高级结构

核酸的多核苷酸链在次级键的基础上，还可形成更为复杂的二级及三级的高级结构。

（一）DNA

1．二级结构1953年Watson 及Crick在化学分析及X光衍射法观察DNA结构的基础上提出了著名的DNA双螺旋结构模型（double helix model）此结构是在核酸一级结构基础上形成的更为复杂的高级结构，即DNA的二级结构，结构如图18-1。

图18－1 DNA的双螺旋结构

P：磷酸基；S：脱氧核糖；G：鸟嘌呤；

A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶C：胞嘧啶

DNA的二级结构即双螺旋结构，其内容可归纳为：

（1）DNA分子为二条多核苷酸链以一共同轴为中心，盘绕成右手双螺旋结构。螺旋直径2nm。螺旋盘绕形成链间的两种沟，即宽的大沟与狭窄的小沟。

（2）二条多核苷酸链的走向相反，通常取左侧链从上到下为5’→3’端，右则链从下向上为5’→3’端，这样二条链构成反平行排列的双螺旋。

（3）二条多核苷酸链借氢键而连系在一起。氢键乃一链碱基上-NH2的氢与另一链上碱基的氧或氮形成。碱基有二个氢键，G与C之间有三个氢键（图18-3）。这种相配关系称为碱基互补或碱基配对。配对的碱基处于同一平面，此平面与双螺旋的中心轴垂直，由于二条链中碱基互补，所以二链彼此又称为互补链。

（4）碱基对之间氢键的能量为3～7kcal/mol，由于氢键多，所以可维系DNA双链结构。另外碱基对彼此间距离为0.34nm,每一螺旋含10个碱基对，故螺距为3.4nm，相邻碱基对间彼此尚有范德瓦士（van der Waals）力作用（此力量为1～2kcal/mol,作用范围为0.5nm），能量虽弱但由于碱基对多，合力也就大。可见碱基对的氢键及碱基对之间的范德瓦士力是稳定DNA成双螺旋结构的主要能量。

上述DNA的双螺旋结构是溶液及活体中常见的形式，通称B型。当B型所处条件的湿度低于75%时，可转变为A型。A型的碱基对不垂直于双螺旋的轴、倾斜约20度，螺距降为2.8nm，每一螺旋含11个碱基对。B型与A型的水合程度不同，它们是DNA分子在天然条件下的两种基本形式。除A、B型外尚发出有C型双螺旋，似B型，螺距3.3nm，第一螺旋含9个碱基对。

DNA双螺旋结构阐明的量重要意义在于第一次提出了遗传信息是以DNA分子中核苷酸的排列顺序为储存方式，从而说明了天然遗传信息的复制过程。

2．三级结构已发现线粒体、叶绿体、细菌、质粒及一些病毒的DNA双螺旋分子尚可形成封闭环状，天然状态的环状DNA分子多扭曲成麻花状的超螺旋结构（superhelix），这些比螺旋更为复杂的结构即DNA分子的三级结构。

真核生理细胞核中的DNA具有一种超螺旋结构，即DNA双螺旋盘绕在组蛋白上形成核小体

（nucleosome）。核小体是染色质（chromatin）的核心小粒，由有140个碱基对的双螺旋DNA缠绕于由组蛋白（H2A、H2B、H3及H4各二分子）组成的八聚体外面，这一DNA股由此形成直径为9nm的超螺旋1.75圈。此核小体又经60个碱基对的DNA双螺旋及组蛋白H1形成细丝（间隔区）与下一个核小体相连接。

核小体的DNA双螺旋为200个碱基对，长度应为0.34nm×200=68nm，但实际长度只10nm，说明DNA双螺旋链进一步螺旋化盘绕在组蛋白八聚体上，其长度压缩了7/8。每6个核小体又绕成一圈形成螺线管，外径为30nm，螺距为10nm。这样DNA分子长度被压缩了6/7。120个螺线管又盘绕成直径为400nm，高为30nm的超螺线管，DNA分子长度又被压缩了40/41，此超螺线管即染色体的单位纤维（unit fiber），长20～60nm。从单位纤维形成染色单体（chromatid），实际长度为2～10nm，DNA分子长度又被压缩了

5/6～6/7。这样从许多核小体组成的串珠样纤维经多层次螺旋化结构到形成染色单体，DNA分子的长度已被压缩至近1/10000。

（二）RNA

RNA分子也是由核苷酸依3’,5’磷酸二酯键形成的多核苷酸链。RNA总是以单链的形式存在，也有5’磷末端及3’羟基末端。RNA单链的局部折叠成的某一片段的A及G …… 此处隐藏：29010字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……