分子生物学第六章--分子生物学操作技术二

第六章 分子生物学操作技术二

第六章 分子生物学操作技术二——基因功能研究技术

本章内容第一节 基因表达研究技术第二节 基因功能研究策略

第三节 蛋白质及RNA相互作用技术第四节 基因芯片及数据分析

第五节 其他分子生物学技术第六节 功能基因组学3

第一节 基因表达研究技术大规模分析基因表达水平 因为EST是从某一特定组织的cDNA文库中随机测序而得， 所以可用未经标准化和差减杂交的cDNA文库EST分析特 定组织的基因表达谱。

基因表达系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE)。SAGE是一种用于定量、高通 量基因表达分析的实验方法。 DNA微阵列或基因芯片的研究。高密度寡核苷酸 cDNA芯片或cDNA微阵列是一种新的大规模检测基因 表达的技术，具有高通量分析的优点。4

一、基因表达系列分析技术(SAGE) SAGE是以DNA序列测定为基础分析全基因组表达 模式的 技术。任何长度超过9-10个碱基的核 苷酸片段都可能代表 一种特异性的转录产 物，因此，根据某个序列占总标签数 的比例 可分析所对应基因的表达频率。 LongSAGE技术。标签来自转录物3’端一段21bp的序列， 可 以进行快速分析并与基因组序列数据相匹 配。其原理与 ShortSAGE方法类似，只是 用了不同的IIS类标签酶 (MmeI),并将程 序做了相应修改。

常规SAGE方法 (short SAGE)基 本 流程

SAGE技术流程

基因芯片技术流程

二、RNA的选择性剪接技术 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从 一个mRNA前体产 生不同的mRNA剪接异构 体的过程。可分为：平衡剪切、5’选 择性剪切、3’选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥性剪切。 常用RT-PCR法研究某个基 因是否存在选择性剪切。

果蝇Dscam 基因 可 以通 过 可 变剪接产生38000 多 种 可 能 的 mRNA 异构体9

选择性剪切的不同类型

RT-PCR检测5个拟南芥转 录调控因子基因的选择性剪切10

三、原位杂交技术 原位杂交(ISH)是 用标记的核酸探针，经放射自显影或 非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核 酸进行定位和相对定量研究的一种手段，分为RNA和染色体 原位杂交两大类。 RNA原位杂交用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等) 标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存 在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA,可通过 放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出 定性定量分析。11

荧光原位杂交(FISH) 首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记， 然后用原位杂 交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素 分子

相耦联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体上的 位置。

四、基因定点突变技术 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸 序列，用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质的结构、 催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调 控 元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。 目前，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱 变法，在基因序列中进行定点突变。

寡核苷酸 介导的 DNA 突变技 术

重叠延伸介导的定点诱变

大引物诱变法15

五、其它研究基因表达技术 实时荧光定量PCR Northern、Southern blotting ……