蛋白质活性测定方法

核糖核酸酶（RNase）的活性测定

（1）溶液的配制：

① 0.1 mol/L pH 5.0的乙酸缓冲溶液：称取5.78 g CH3COONa, 加入1.7 mL CH3COOH, 用蒸馏水稀释至500 mL。

② 0.05 % RNase酵母溶液：称0.05 g RNase酵母，用0.1 mol/L pH 5.0的乙酸缓冲溶液溶解并稀释至100 mL。

测活方法：

（2）用移液管移取已配制好的0.05 %的核糖核酸酵母溶液2.5 ml于比色皿中，加入一定量的样品RNase A溶液，迅速摇匀，以蒸馏水为参比，在300 nm波长下每隔30秒测一次吸光值，共读3分钟， 得到一组对应于时间t(min)的At值。当样品管反应3小时后再测定300 nm处的吸光值Af, Af为最终的光吸收，分别求得一组对应于t的log(At-Af), 以log(At-Af)对时间t作图应得到线性关系，画出直线。求出直线斜率的数值S，将S带入标准曲线，求得活性回收率。将S带入下列公式中，可求出酶的活力。

单位 / mg = S × (-2.3) ×4 / (样品管中含酶的数量)

胰凝乳蛋白酶（α-Chy）活性测定

用胡梅尔(Hummel)法测定α-胰凝乳蛋白酶[2]：

(1) 原理：α-胰凝乳蛋白酶优先催化水解结合有氨基酸（如酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的L-异构体）的肽键。我们可以通过在256 nm处测定吸光度增大值的办法来测定反应的速度。苯甲酰-L-酪氨酸乙酯的水解反应引起吸光度的增大。

(2) 定义：一个凝乳蛋白酶单位相当于在pH值为7.8，温度为25 ℃时，每分钟水解1 μmol苯甲酰-L-酪氨酸乙酯(BTEE)所需的酶量。

(3) 试剂配置方法：

Tris缓冲液(pH: 7.8)取0.969 g三（羟甲基）氨基甲烷和1.47 mg二水氯化钙溶于80 mL蒸馏水中，用1 N的盐酸将pH值调至7.8，并定容至100 mL。 ①盐酸(HCl): 0.001 moL/L

②酶溶液：先用盐酸溶解酶，使溶液浓度达到1 mg/mL，然后再用盐酸稀释，使最终浓度达到0.5～1.0 U/mL。

③底物溶液：取33.5 mg苯甲酰-L-酪氨酸乙酯溶于50 %的甲醇(63 mL甲醇与50

mL蒸馏水混合)，定容至100 mL。

（4）操作步骤：用移液管将1.5 mL Tris缓冲液和1.4 mL底物溶液滴入一只1 cm比色皿，并加热至25℃，加0.10 mL酶溶液，摇匀。用分光光度计(256 nm)测定反应混合物的吸光度，在约5.0 min内每隔1.0 min读取吸光度一次，直到每分钟吸光度的增大值达到稳定为止。

（5）计算

用以下公式计算酶的活性：

E256 U/mg0.964 Ew 3

式中：Ｅ256—在256 nm处测得的每分钟内吸光度的增大值

Ｅw—每0.10 mL所用酶液中含酶的重量(mg)

0.964—1 μmol BTEE的吸光度(256 nm处)

3—反应液的总体积

胰蛋白酶（Trypsin）的活性测定

用施韦尔特-竹中（Schwert & Takenaka）法测定胰蛋白酶[3]：

(1)原理：胰蛋白酶将N-苯酰基-L-精氨酸从BAEE中释放出来，用分光光度计于253 nm处跟踪测定由该反应引起的吸光度增大情况。

(2)定义：一个胰蛋白酶单位相当于在规定条件下每分钟使吸光度增大0.001时所需的酶量。

(3)试剂配置方法：

①底物溶液：取30.9 mg BAEE，280 mg二水氯化钙和566 mg三羟甲基甲烷溶于70 mL蒸馏水中，将pH值调至7.6。定容至100 mL。

②盐酸（HCl）：0.001 mol/L

③酶溶液：酶用0.001 N盐酸溶解。1.0 mL配制酶溶液中应含有150 U左右。

(4) 操作步骤：用移液管将2.8 mL底物溶液滴入1 cm比色皿，调温至25 ℃。添加0.20 mL酶溶液，混合。用分光光度计于253 nm处以蒸馏水为参比测定吸光度，直至每分钟吸光度增大值达到恒定为止。

(5) 计算：

用以下公式计算活性:

E253 U/mg0.001 Ew

式中 Ｅ253—每分钟内253 nm处吸光度的增大值

0.001—一个酶单位每分钟使吸光度增大0.001

Ew—0.2 mL所用的酶溶液中含酶的重量(mg)

Lys活性的测定

取溶壁球菌干菌粉少许，加入少量0.067 mol/L的磷酸缓冲液(pH=6.2)，用玻璃棒研磨匀浆，再加入磷酸缓冲液至OD值为0.6-0.8即可。用移液管移取3.0 mL配置好的溶壁球菌菌液于比色皿中，加入一定量的Lys溶液(酶量在100 ug左右)，迅速摇匀，以蒸馏水为参比，在450 nm的波长下每隔30秒测一次吸光值，共读3分钟，以吸光度对时间作图，取最初线性部分，其斜率即为吸光度值的变化率。在以吸光度值的变化率对加入标准蛋白的质量作图，用同样的方法测定样品的吸光度值的变化率，依据标准曲线求得蛋白的绝对量或浓度，与同时对照的标准蛋白活性绝对值或浓度比较，便可计算出活性回收率。

中国生物制品标准化委员会编. 中国生物制品规程[M]. 北京: 化学工业出版社, α-Amy活性的测定

（1）溶液的配制：

①0.02mol/L磷酸缓冲液（PH7.0）：称取1.8g磷酸氢二钠和1.0g磷酸二氢钾，用水溶解后定容至1L。

②0.1%淀粉溶液：称取100mg可溶性淀粉与50mL烧杯中，加少量蒸馏水制成糊状，然后转移到盛有80mL0.01mol/L氢氧化钠的150mL烧杯中煮沸，冷却后倾入100mL容量瓶中，用0.01mol/L氢氧化钠稀释至刻度。

③0.005mol/L碘液:称取3g碘化钾和1.3g碘用水溶解后，稀释至0.05mol/L碘液，然后再稀释10倍。

④标准酶液：准确称取1.0mg高纯度α-Amy于离心管中，加入1mL水，溶解后，于12000RPM离心5分钟，上清液转移到另一离心管中备用。用时稀释100倍。

（2）活性测定

取7支比色管，用移液管准确加入3.0mL0.1%淀粉溶液，5.0mL磷酸缓冲液，然后分别加入稀释标准酶液0.0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6mL，在37度温热15分钟后取

出立即冷却，于每个比色管中各加入0.4mL0.005mol/L碘液，用水稀释至刻度，摇匀，以蒸馏水为参比，在波长580nm条件下，用分光光度计测量吸光度，在一定范围内，吸光度减弱的程度与酶活力大小成比例。