最详细的Western_Blot过程步骤详解(3)

Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

白印迹。

就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。

就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。

Y. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？

解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。

Z. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？ 解答：可以。

AA. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？

解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢， 你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。 BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？

解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。

Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

CC. 采用tank system有什么讲究？

解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），如 28V 14－16hrs。

DD. 做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？

解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。

EE. 膜一般要如何处理？

解答：一般用甲醇泡泡就可以了。

FF. 如果是6×8转印膜，要加多少一抗？

解答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。

GG. 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。

解答：无要求。

HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？

解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的

Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。

II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究？

解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－ 2mm，而膜的长宽分别比胶大1－ 2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。

JJ. 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？

解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge， 湿转36V ， 3－5hrs就可以了， 可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－page， 48V 10hrs－16hrs。 KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上， 转移效率低怎么样解决？

解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低

Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。

至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。

LL. 如何选择最合适的蛋白杂交膜？

解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。

硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于 0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而