玉米秸秆干发酵制取沼气的试验研究(5)

以上菌株均为本实验室筛选和保存。

２．１．３培养基

（１）固体培养基

配方：马铃薯、葡萄糖、琼脂、自来水、ｐＨ值自然。

ＰＤＡ培养基的配制方法：称取去皮新鲜的马铃薯２００９切成小薄块，将其放于小铝锅中加入自来水然后放置于电炉上煮沸３０分钟，用双层纱布过滤，滤去马铃薯块，将滤液补足至１０００ｍＬ后倒入小铝锅中，煮沸加入葡萄糖２０９，琼脂２０９，略加热搅拌使之完全溶化，溶化后分装。分装完毕后塞好８层纱布，另用二层报纸覆盖并用细线捆扎好，在高温蒸汽１２卜１２５℃灭菌３０ｍｉｎ。取出后放冷储藏备用。

将白腐菌在无菌操作台里接种到ＰＤＡ培养基上，放于恒温培养箱内培养５ｄ，制备固体培养基后将其贮存。

（２）马铃薯、葡萄糖、琼脂斜面培养基

相应的马铃薯、葡萄糖液体培养基加入２～２．５％的琼脂，将其放于试管中用于固体斜面制种。

（３）液体培养基

配方：马铃薯、葡萄糖、自来水、ｐＨ值自然。

液体培养基的配制方法：按照制备ＰＤＡ培养基方法（注：不加琼脂），制备后将其放于２５０ｍＬ－－角瓶内，在无菌操作台内用接种环取固体培养基卜２环于三角瓶内的斜面上，画ｓ型，然后将其放在水浴振荡器内保持温度为３１℃，转速为３００ｒ／ｍｉｎ，连续培养３１２

牛粪 秸秆 厌氧发酵

沈阳农业大学硕士学位论文

天。塞好８层纱布，另用二层报纸覆盖并用细线捆扎好，在高温蒸汽１２１—１２５＂Ｃ的条件下灭菌３０ｍｉｎ，取出后备用。

２．２试验药品与仪器

２．２．１化学药品

葡萄糖、醋酸、醋酸钠、羧甲基纤维素钠、氢氧化钠、磷酸、酒石酸钠、琼脂。２．２．２试验仪器

水浴振荡器、三角瓶、接种环、酒精灯、普通摇床、电动搅拌器、电子天平、分光光度计、箱式电阻炉、无菌操作台、高压灭菌锅、电炉、水银温度计、移液管、容量瓶、锥形瓶、干燥箱、高温炉、烧杯、平底砂芯滤斗、圆底砂芯滤斗、量筒、试管、精密ｐＨ试纸、漏斗、吸管、水浴锅、玻璃滤器、广口瓶、电子显微镜、电冰箱、玻璃棒、吸耳球、培养皿、医用纱布等。

２．３纤维素（半纤维素）酶活的测定

粗酶液：将２．０９发酵的固体基质，用５０ｍＬｐＨ＝４．８的醋酸一醋酸钠缓冲液浸泡３ｈ后，用滤纸过滤，得滤液，即为粗酶液。

纤维素（半纤维素）酶活的测定：在５０ｍＬ比色管中加／ｋ０．６ｍＬ适当稀释的酶液，在５０＂（２水浴锅中预热５ｍｉｎ后加入１．４ｍＬ羧甲基纤维素钠（木聚糖）溶液，水浴保温反应３０ｍｉｎ后，立即加入２．０ｍＬ２ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液和３．０ｍＬＤＮＳ，沸水浴５ｍｉｎ，终止反应，流水冷却，在５４０ｎｍ下测定吸光值（０Ｄ），以２．０ｍＬ２ｍｏｌ／Ｌ的ＮａＯＨ溶液灭活酶液同上操作为对照样，读三次数据，吸光值为其平均值。酶活力定义为上述条件下，每分钟释放ｌｌａｍｏｌ的木糖的酶量为１个酶活单位（ＩＵ）。

２．３．１试剂及溶液（以下为分析纯）

（１）羧甲基纤维素钠（ＣＭＣＮａ）溶液：先配０．２ｍｏｌ／ＬｐＨ＝６．５的磷酸缓冲液（２０．８９ＮａＨ２Ｐ０４和２３．８７６９Ｎａ２ＨＰ０４，定容至１０００ｍＬ），再按１．ＯＯｇＣＭＣＮａ／１００ｍＬ磷酸缓冲液的量配制ＣＭＣＮａ－ＣＭＣ纤维素酶底物液。

（２）木聚糖半纤维素酶底物液：先配０．１ｍｏｌ／ＬｐＨ４．８的醋酸一醋酸钠缓冲液（３．００９醋酸和６．８０９醋酸钠，定容至１０００ｍＬ），再按１．０９木聚糖／ｌＯＯｍＬ缓、冲液的量配制半纤维素酶底物液。

（３）ＤＮＳ试剂的配制：称取１０９３，５二硝基水杨酸溶于水中，全部溶解后，加．Ｋ２０９ＮａＯＨ、２００９酒石酸钠，加入蒸馏水，使总体积至－５００ｍＬ左右，加热溶解后，加２９苯