影响ELISA实验效果常见分析

一个在医学上很有参考价值的文章

影响ELISA实验效果常见分析

ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。我将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下，以期给同行带来一些启发，提高试验质量。

在实际操作中，除了选择优良试剂外，必须严格按照操作步骤进行操作，同时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每一份标本，才能保证检测质量。现在国内已有相当数量的单位拥有全自动酶标仪，这对于实现ELISA标准化检测、提高检测质量起到了重要作用。

操作步骤 可能原因 解决办法

选择试剂 选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。

加 样 1.血清或血浆标本分离不好即进行加样；

2.手工操作中，加样板过多造成加样后放入孵箱前等待时间过长(特别是室内温度较高时)；

3.加完标本再加酶试剂时酶溅出孔外。 1.标本为血清：最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp离心15分钟；标本为血浆：必须使用含抗凝剂的血液标本收集管，采血后必须立即颠倒采血管混合5-10次，放置一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几天内检测，可放在2-8℃冰箱中，若要贮存，则置于-20℃的低温冰箱内。

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2.加样后及时放入孵箱。

3.加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

4.如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他后处理仪器加酶试剂。

5.标本较多时，请分批操作。

孵 育 1.孵育时未贴封片或加盖，使标本或稀释液蒸发，吸附于孔壁，难于清洗彻底；

2.孵育时间人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔周围，难以清洗彻底。 1.贴封片或加盖；

2.按说明步骤严格控制操作时间。

洗 板 1.采用手工洗板,孔与孔之间液体交叉。

2.采用半自动洗板机洗板时，洗液量不足，导致洗板不彻底；洗板针堵塞，抽吸不完全；洗板不畅，导致洗板效果差。

3.反应板过多造成洗板等待时间长。 1.保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸（选择干净、无或少尘的吸水材料）上轻轻拍干；

2.合理安排，或多用几台洗板机。

显 色 1. 显色剂配制后放置时间过长或使用过期显色剂；

2. 加显色剂时溅出孔外造成液体回流。 1. 显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色的TMB显色剂不用；

2. 加样时保持显色剂不外流；

3.A、B液应避免接触金属器械。

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终 止 加终止液时产生较多气泡，导致假阳性增加。 加终止液时应避免产生气泡。

读 板 读板时板底不清洁。 应保证酶标板清洁。

全过程 1.整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸;

2.实现ELISA检测标准自动化，有效提高检测质量。

ELISA法广泛用于乙肝两对半检测。但ELISA测定中影响因素较多，有些因素会导致结果假阳性或假阴性,本文就ELISA测定乙肝两对半的影响因素及对策报作如下讨论:

1． 样本采集与处理的影响

1.1标本严溶血及混有红细胞的血清易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样的活性，催化底物显色造成假阳性，严重溶血标本禁用。

1.2采血试管洗涤不彻底、反复使用易交叉污染；塑料试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。最好使用一次性玻璃试管或真空管采血管；并使用非抗凝标本，肝素抗凝血浆会增加OD值，可能与高浓度肝素具有强大的负电荷能吸附酶标记物不易洗脱有关；EDTA钠或钾盐、酶抑制剂（如NaN3）可抑制ELISA系统中辣根过氧化物酶活性。

1.3标本凝固不全 ，正常血液采集后1/2~2h开始凝固，18~24h完全血块完全收缩。在工作中，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白

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原，在ELISA测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块或附着在酶标板孔壁内使酶标记物不易洗掉，易造成假阳(阴)性结果；因此血液标本采集后必须使其充分凝固后再分离血清，或标本采集时用带分离胶的采血管或于采血管中加入适当的促凝剂。

2、试剂的影响

2.1乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度与特异性存在一定的差别，资料显示[1]，不同厂家试剂的特异性和敏感性分别为89.4%—99.3%,78~89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差大于15%；标记酶的活性及显色液的稳定比较差。使用质劣的试剂必然导致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关键之一。

2.2不同方法学的检测试剂，会使两对半结果出现一些不同。例如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂的制备应该考虑亚型及型浓度的问题。

3、操作技术的影响

3.1加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。由于吸嘴构造特殊，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。

3.2温浴影响，96孔酶标板结构特别；易产生边缘效应，抗原抗体结合及酶促反应对温度有严格要求，酶标板周围与内部孔升降温速率不

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同，造成周边与内部孔结果差异；干浴与水浴存在明显的差异，尽可能使用水浴，并要求固相板放入水中，减少受热不均，贴密封膜，防止污物浸入。

3.3冼涤是ELISA操作的重要环节，手冼条件一致性较差，对结果影响较大，半自动与全自动冼板机使用不当也会影响结果，血清中残留的的纤维蛋白丝或洗涤液析出的结晶易使洗板机针小孔全阻塞或半阻塞状态，造成未结合标记酶洗脱不彻底，导致“花板”造成假阳性或假阴性；所以操作洗板机过程中要不时观察洗板机针孔内洗液的通畅状况，及时纠正，洗板机不用时应用去离子水清冼几遍。

3.4肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果的准确性，必须使用酶标仪检测，以保结果一致性。

4、HooK效应影响

随着ELISA一步法的应用，一些标本中抗原含量过高，产生HooK效应。影响检测结果，采用同步稀释测定或使用线性范围高的两对半定量法可以减HooK反应的发生。

5、干扰物质的影响

有人认为大约40%的人血清标本中含有非特异性干扰物质，可以不同程度影响检测结果；常见的干扰物质有：类风湿因子、补体、嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠Ig (s)抗体、交叉反应物质和其它物质等。如RF因子可与标记二抗的FC段法结合造成假阳性，补体从C1q活化，使一抗和酶标二抗的抗体分子发生变构，Fc的C1q分子结合点暴露出来，则补体C1q可将二者连接起来造成

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假阳性，采用56℃30分钟灭活补体可降低假阳性率，高浓度的AFP（如孕妇），在储存过程中可能形成二聚体会导致本底过深影响检测结果。

6、药物的影响

6.1、高效价的乙肝免疫球蛋白会与HBsAg形成复合物，影响HBsAg的检出， …… 此处隐藏：1917字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……