综合实验二 脱镁叶绿酸的分离、抗自由基活性和微囊的制备

综合实验二

脱镁叶绿酸的分离、抗自由基活性和微囊的制备

研究材料：蚕砂

提取成分：脱镁叶绿酸 制剂：微囊

本实验提供了参考的微囊制备方法，要求学生自行设计一种不同的微囊制备方法。

一、实验目的

1. 了解蚕砂中脱镁叶绿酸提取分离原理和方法；

2. 了解脱镁叶绿酸的结构表征和含量分析测定方法。

3. 了解微囊的基本原理；

4. 比较不同微囊的工艺方法的包封效果。

二、实验原理

脱镁叶绿酸(Pheophorbide)是由叶绿素分子脱去镁离子后进一步水解而形成的化合物，具有显著的抗炎、抗肿瘤、保护胃肠粘膜等药理作用。

中药蚕砂在乙醇、丙酮等有机溶剂的萃取下获得叶绿素粗品，然后在酸性条件下脱去植醇长链和金属离子，得到主要产物脱镁叶绿酸a，再对产物进行盐酸乙醚转溶、真空干燥得到纯度很高的脱镁叶绿酸。

制备微囊有不同的方法：复凝聚法是利用两种电荷相反的高分子材料，交联

形成复合囊材，将囊心物包裹其中形成微囊；溶媒－非溶媒法是在囊材溶液中加入一种对囊材不溶的溶剂(非溶剂)引起相分离，而将药物包裹成囊的方法；液中干燥法是从乳状液中除去分散相挥发性溶剂以制备微囊的方法，亦称乳化－溶剂挥发法。

三、脱镁叶绿酸的提取

<1>浸提：取中药材蚕砂50g于500ml圆底烧瓶中，加100ml水软化2h；加

入150ml丙酮，在70℃恒温水浴中回流浸提90min，抽滤，得浸提液A。滤渣倒回圆底烧瓶中，再加入50ml蒸馏水，100ml丙酮，在70℃恒温水浴中回流浸提60min，抽滤，得浸提液B。合并浸提液；

<2>萃取：用旋转蒸发仪在50℃下将浸提液浓缩至50ml，移至500ml分液

漏斗中，依次加入150 ml乙醚、30%HCl 100ml，振荡5min，进行转溶萃取，静置至完全分层。将下层水溶液放出置于烧杯，放入冰水浴中，慢慢滴入NaOH的饱和溶液，同时进行搅拌，直至 pH 值在2.5-3之间，3000rpm离心10min，所得沉淀即为脱镁叶绿酸。

<3>真空干燥：将沉淀在60℃下真空干燥箱中烘干2h，称重。

四、脱镁叶绿酸的分析测定方法

1. 含量测定

方法：准确称取10mg样品，溶于100 mlDMF溶液中，于波长667nm测定

吸光值。含量计算方程Y(吸光值)=0.0275X(mg/L)+0.0025。

2. 紫外和荧光光谱测定

对产物进行紫外荧光测试：取10mg脱镁叶绿酸a提取物粉末溶于100mlDMF

溶液中，在300nm—800nm波长范围内进行紫外和荧光扫描。

五、抗自由基活性测定

以维生素C为对照，将样品分别配制0、25、50、100、200、400 mg/L各供试品溶液，取2m l 加入2 m l 1 mM DPPH 的乙醇溶液, 混合均匀，黑暗下室温避光反应30 m in，在517 nm 处测定吸光度, 以乙醇替代样品为空白组, 计算自由基清除率(% ) = [ 1- 样品吸光值/空白吸光值]× 100% 。

六、微囊的制备

1、复凝聚法

取脱镁叶绿酸0.1g 置干燥研钵中研细, 加阿拉伯胶粉1g和少量水研磨成混悬液,再加入30mL蒸馏水,搅拌均匀, 然后加入与阿拉伯胶等量的明胶溶液(1g用30mL水40℃溶解保温), 混匀, 置于烧杯中于38℃的恒温水浴中搅拌。滴加10％醋酸调节pH 值至3.5 ～ 4.0, 继续搅拌约10min(速度为25 ～30 r /min)后, 加入与体系等温的2 倍蒸馏水, 体系自然冷却至30℃以下后, 冰浴迅速冷却至10℃以下, 用25％戊二醛溶液适量固化15min, 静置使其充分沉降, 倾去上清液, 微囊过滤, 用水洗至无醛味,即得脱镁叶绿酸微囊。

2、自行设计一种微囊制备方法。

七、微囊质量分析

1、微胶囊大小的测定

在显微镜下观察测定100 微胶囊的直径，记录在下表中。

按下式计算微胶囊的平均直径：

Dav = ∑(nidi)/ ∑ni

式中ni＝个数，di＝体积直径

2、载药量和包封率的测定

载药量是指包裹在微囊中的药物占微囊量的百分比例。

包封率是指包裹在微囊中的药物占投药量的百分比例。

样品液准备：

精密称取微囊适量, 于研钵中研细后, 精密称取约100mg, 置于50 mL棕色

量瓶中, 加入0. 1 mol /L的盐酸溶液20mL, 超声30min使微囊完全破坏(镜检已无微囊存在), 用DMF稀释至刻度, 摇匀, 滤过, 精密量取续滤液1mL于10 mL棕色量瓶中, 加入DMF定容至刻度, 于667 nm 波长处测定吸收度A 值。

八、实验结果与讨论

1. 记录实验条件、现象、各试剂用量及产品的重量和含量。

2. 脱镁叶绿酸的紫外和荧光光谱。

3. 对自由基的清除率。

4. 微囊的大小、载药量和包封率。

九、思考题

1. 试分析哪些因素影响产品的产率和纯度，怎样控制？

2. 脱镁叶绿酸具有什么光谱特征？

3. 自由基的清除能力与哪些因素有关？

4.微胶囊的形状、大小和包封率与那些因素有关？如何控制？

5．试比较2种微囊包封率的优缺点。

所需试剂：

蚕砂1公斤、丙酮6瓶、乙醚3瓶、盐酸2瓶、DMF2瓶、DPPH1瓶、明胶、阿拉伯胶、戊二醛各1瓶。