第五章 目的基因的获取、扩增与检测及相关技术-之1获取-基因组文

目的基因

第五章

目的基因的获取、扩增 与检测及相关技术

目的基因

基 因 的 获 得

1、物理化学方法 2、鸟枪法 3、化学合成法 4、基因文库 5、逆转录合成 6、 PCR技术 7、凝胶电泳 8、酵母双杂交系统 9、杂交技术 10、生物芯片 11、 DNA测序

基因的扩增

基 因 的 检 测

目的基因

第一节 目的基因的获取及相关技术 一、物理化学方法 二、鸟枪法 三、化学合成法 四、凝胶电泳 五、PCR技术 六、基因文库(基因组文库、cDNA文库) 七、逆转录合成 八、酵母双杂交系统

目的基因

六、基因文库 1、基因文库的基本概念 2、基因文库的构建过程 3、基因文库中目的基因的筛选

目的基因

1、基因文库的基本概念 是含有某种生物体全部基因的随机片断 的重组DNA克隆群体。 根据构建方法的不同，基因文库分为： (1)基因组文库(含有全部基因)

(2) cDNA文库(含有全部蛋白质编码的结构基因) complementary DNA(互补DNA)

目的基因

基因组文库的构建基因组DNA限制性内切酶基因重组

体外包装

转化细菌

目的基因

目的基因

克隆数的确定(基因文库的容量)任一DNA序列在文库中出现的概率：

ln(1 p ) N ln(1 I / G )N:该序列需要克隆的总数； p:任一基因被克隆(或存在于基因文库中)的概率，一般为 99%;812674.78905768963633545194372407 I:待克隆DNA片段的长度，假定为17kb; G: 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp

目的基因

将数据代入上式

ln(1 0.99 ) N ln(1 17 kb / 30 Mb)= 8.1×105 N的含义是克隆大小为17kb的人类DNA时， 所构建的基因文库数必须在 8.1×105 以上时，才能以99%的概率得到此克隆。

目的基因

2、基因文库的构建过程 (1)基因组文库的构建 (2) cDNA文库的构建

目的基因

组织

载体 ( 选择一种)

mRNA cDNA

DNA部分或完全 消化的 DNA

甲基化，加接头 的双链 DNA

大小分级

可供克隆的 DNA 片段 连接 DNA 片段和载体 重组载体 DNA 导入 E.coli (体外包装或转化) 基因库的鉴定与效价测定 筛选目的基因 扩增文库长期保存

构建基因组 DNA 和 cDNA 文库的流程示意图

目的基因

(1)基因组文库的构建

构建基因组文库时先提纯生物的总DNA, 通过机械剪切或酶切使其成为一定大小 的片段，连接到适当载体(常为 噬菌体) 上，经体外包装转染细菌，得到一群含 不同DNA片段的重组噬菌体颗粒。此即 是基因文库。这群DNA片段含盖基因组 全部基因。

目的基因

基因组文库的构建基因组DNA限制性内切酶基因重组

体外包装

转化细菌

目的基因

噬 菌 体 为 载 体 的 基 因 文 库 的 构 建

目的基因

基因组文库的构建过程 ①生物基因组DNA的提取和片段化 ②载体的选择和制备 ③DNA片段和载体

的连接 ④重组体转化宿主细胞 ⑤初库的扩增

目的基因

①生物基因组DNA的提取和片段化 用限制酶片段化： 1~3kb, 10~30kb 随机片段化：超声波( 300bp )、高速搅拌 ( 8kb )