反向斑点杂交技术及其在基因诊断中的应用

反向斑点杂交技术及其在基因诊断中的应用

林炳生 张太松

510080 广州 中山大学达安基因诊断中心

【摘要】反向斑点杂交采用生物素标记的引物进行靶核酸的扩增，将产物同固定在尼龙膜上的探针进行杂交，一次杂交反应可以检测多种靶序列。该方法具有快速、简便，高灵敏度和特异性的特点，广泛应用于病原体检测、基因突变检测、基因分型以及遗传多态性检测等多个方面，具有潜在的临床应用价值。

【关键词】反向斑点杂交；基因诊断

Reverse dot blot method and its use in gene diagnosis LIN Bingsheng, ZHANG Taisong. Daan Gene Diagnostic Center of Sun Yat-sen University,Guangzhou , 510080 China,

【Abstract】 The reverse dot blot(RDB) method, by using biotine labeled primers, amplify the target nucleic acid and hybridize with the probes covalently bound to the nylon membrane. It can identify several kinds of target sequence in a single assay with reliability and specificity. RDB assay was widely applied to the pathogen identification, gene point mutation assay, genetic polymorphism detection, and provides a promising tool for clinical nucleic acid analysis.

【Key words】reverse dot blot(RDB)；gene diagnosis

反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)是Saiki等[1]提出的一种斑点杂交技术，该技术采用固化了多种特异性探针的膜条与扩增靶序列杂交，使一次杂交即可同时筛查被检DNA中的多种突变。这种以膜上固定探针取代固定靶DNA的方式，改变了传统杂交法一次只能检测一种突变的模式，具有快速、简便、高敏感度和特异性强的特点，尤其在基因突变检测、基因分型、病原体的检测等领域有其独特的优势。本文拟对该技术的原理、方法、特点及其应用作简要综述。

1 原理和方法

RDB检测点突变仍遵循等位基因特异性寡核苷酸(allele specific oligonucleotide, ASO)法的基本原理[1]，即通过位于寡核苷酸探针中部的等位基因(或序列)特异性碱基与靶序列DNA的碱基配对和严格条件下杂交和洗脱来达到检测基因中少数碱基变化(少至单个碱基)的目的。与传统ASO点杂交不同的是，RDB以膜上固定ASO探针取代了固定靶DNA(基因组DNA或PCR扩增片段)，这就是“反向”的含义（如图1所示）。最初探针固定的方式是先用末端转移酶在合成的ASO探针的3'端加上一段多聚(dT)尾链(一般为400个碱基左右)，这种带尾的ASO点到膜上后再经紫外光照射，其多聚(dT)即可与尼龙膜表面的氨基作用而结合在膜上。1991年Zhang等[2]建立了使ASO与膜共价结合的化学法。此法先用EDC(乙基二甲氨基丙碳二亚胺)对膜进行“活化”处理，继而将5'端带有修饰氨基“臂”的-NH2与膜表面的-COOH相互反应形成共价结合。由于化学法结合效率高(80-90%)，且稳定性好(制备的ASO膜条室温下至少可存放半年)，目前已被普遍采用。

RDB的主要特点是将多种不同序列的ASO固定在同一膜条上，其技术关键是根据靶序列位点的碱基组成和结构特点，通过优化杂交条件，使整个检测结果达到最佳的杂交信号。尽管检测信号在各个杂交斑点上所显示的强度可能有些差别，但这不会影响阴阳性结果的判断

[1]。RDB杂交信号的检测一般采用非放射性物质。非放射性物质标记的方法有扩增片段的随机标记法[3]和PCR引物的5'端修饰法[1,2]，后者操作方便，被更多的研究者使用。

2 技术特点

反向斑点杂交具有以下特点：①将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样本DNA又互不干扰，故能一次性筛查多个样本，每个样本又可筛查多种不同的位点；②方便快捷。膜条制备时间较短，并能大量预先制备放于4℃保存待用(至少可存放半年)；经过一次PCR扩增和一次反向杂交就可以完成对标本的检测，若采用快速导流型杂交仪，则整个杂交过程在 60min 即可完成。③非放射性标记引物，避免同位素的半衰期所带来的引物保存期短的问题，并使操作更安全。④充分利用PCR的高灵敏度和探针杂交的高特异性。国内有学者对HBV进行了基因分型，检测下限可达到103拷贝/ml，所有样本的RDB分型结果和测序分型结果完全一致[4]。

3 应 用

由于RDB具有方便快捷、高敏感度、高特异性等特点，目前已被用于基因突变检测，基因分型，病原体的检测等多个领域。国内外多个研究表明，RDB用于基因诊断领域具有很好的优势，并具有潜在的临床应用价值。

3.1 基因突变检测

β地中海贫血(β地贫)是迄今已阐明其分子病理学的少数遗传病之一，因此也就成为最早用RDB进行基因诊断的对象[1]。β-地贫的分子基础主要是点突变，目前全球已发现100种以上的点突变，其突变类型的分布有着明显的种族和地域差异[5]，在我国人群中已发现了21种β-地贫突变。荣卡彬等[6]使用RDB方法对1004例疑似β-地贫病例进行基因诊断，结果有283例β-地中海贫血，共发现11种突变。其中CD41-42(40.89%)，IVS-2-654(22.68%)，CD17(12.71%)，TATAbox-28(14.43%)，CD43(3.78%)和CD26(1.72% )，占突变的95%以上。因此，反向斑点杂交法具有快速、准确的优点，适用于普通人群的β-地中海贫血分子检测和产前诊断。

RDB在耐药检测中有广阔的应用前景。在耐药检测中以耐多药结核病(MDR-TB )的研究最为深入。MDR-TB出现主要的耐药机制是细菌染色体的基因变异。目前发现的突变基因有

[7]：耐异烟肼(INH)的katG，inhA，ahpC，oxyR基因，耐利福平(REP)的rpoB基因，耐链霉素耐的rpsL, rrs基因，耐氟喹诺酮类(OFL)的gyrA ,gyrB基因；传统的药敏实验至少需要7-10日才能确定其耐药性。梁建琴等[8]设计与合成用于检测结核分支杆菌耐INH kaG和inhA基因的寡核苷酸探针，使用PCR-RDB方法检测临床分离株。实验发现：20株INH敏感株中，仅9株为野生型，余11株中，10株KaG基因315位密码子AGC-ACC, 1株AGC-AAC；15株为inhA野生型，另5株inhA基因-15位C-T突变。36株耐药株中，17株kaG野生型，18株AGC-ACC，1株与所试探针不杂交，PCR-DC显示KaG基因279位密码子GGC-GAC，11株inhA突变。kaG基因RDB突变检出率为50%,inhA基因突变检出率为30.56%。以传统药物敏感度试验结果为标准[9]，应用PCR-RDB检测结核分枝杆菌INH耐药基因，如表1。PCR-RDB的这些结果只用2日就可以完成。

研究者由此得出的结论：耐利福平的痰标本中，膜片检测与药敏结果的符合率为92.3%；非结核病的痰液标本中，检测灵敏度为91.7%，特异度为78.1%，阳性预测值61.1%,阴性预测值96.1%。

3.2病原体的检测

自从PCR技术问世以来，病原体检测得以快速而方便的进行。有些病原体如肺炎链球菌临床上主要依靠细菌培养法确诊，而且肺炎链球菌是苛养菌，营养要求高，培养时间长，尤其是患者使用抗生素后常常出现假阴性结果[12]，因此临床上急需一种更为快速、准确的诊断方法。樊慧珍等[12]建立了快速检测肺炎链球菌的PCR-RDB方法。利用肺炎链球菌特异的自溶素基因序列设计引物[13]，PCR合成一段263bp的DNA探针，然后用生物素标记的细菌DNA与该探针进行反向斑点杂交，并将该方法应用于痰样本的检测，可检测到10ng的细菌DNA。该方法使得肺炎链球菌检出率高，敏感性和特异性都很好。RDB还可以同时检测多种性传播疾病（STDs）。丁守怡等[14] 研制的低密度基因芯片可同时检测H …… 此处隐藏：3632字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……