叶绿体色素的提取和理化性质的鉴定 实验报告

实验报告

实验名称：叶绿体色素的提取、分离及其理化性质

日期：2011年11月2日 小组成员：——（2010******）

——（2010******）

专业：生物科学 生物科学与生物技术

班级：******

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摘要

本实验对叶绿体中的色素进行了提取、分离和理化性质的鉴定。实验采用纸

2+

层析法进行分离，并从叶绿体色素的荧光现象、皂化作用、Mg的取代以及色素光谱对其理化性质进行了鉴定。 一、 实验目的

1. 以植物叶片组织为材料,提取叶绿体色素; 2. 以纸层析法分离其成分;

3. 鉴定叶绿体色素的理化性质。

二、 实验原理

1. 提取: 叶绿体中含有叶绿素(叶绿素a与b)和类胡萝卜素(胡萝卜素和叶黄素)，这两类色素均不溶于水，而溶于有机溶剂，故常用乙醇、丙酮等有机溶剂提取。

2. 分离: 当溶剂沿支持物不断向前推进时，由于叶绿体中不同色素分子结构不同，在两相(流动相与固定相)间具有不同的分配系数，因此它们移动速率不同。对叶绿体色素进行层析可将不同色素分离。

3. 理化性质的观察: 叶绿素是一种二羧酸酯，在碱作用下，发生皂化反应；在弱酸作用下，叶绿素中镁可被氢原子取代而成为褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，叶绿素具有荧光，故从与入射光相垂直的方向观察叶绿素溶液呈血红色。叶绿素的化学性质不稳定，易受强光氧化，特别是当叶绿素与蛋白质分离后，破坏更快。 三、 实验材料及用具

1. 材料：菠菜；

2. 用具：天平、研钵、三角漏斗、滤纸、层析缸、毛细管、分光镜、量筒、烧杯、试管等；

3. 试剂：丙酮、碳酸钙、层析液（石油醚：丙酮=25：3），20%KOH-甲醇、乙醚、1%HCl、醋酸铜。 四、 实验步骤

1. 叶绿体色素的提取

1) 取新鲜菠菜叶片2克,擦干,去中脉,剪碎放入研钵；

2) 加入少许石英砂和CaCO3，再加入无水丙酮10ml，研磨成匀浆，再加

丙酮15ml；

3) 用漏斗滤去残渣,得叶绿体色素提取液(置于暗处)。 2. 纸层析分离叶绿体色素

1) 层析样纸制备：将优质滤纸剪成3cm×9cm的长条，将一端剪成中央留约1cm×0.5cm的窄条；

2) 点样：用细玻璃棒蘸取叶绿体色素提取液点于层析纸的窄条上端中央

部，晾干后在原处重复点样7-8次；

3) 展层：在层析缸中加入3-5ml层析推动液，然后将已点样的层析纸插

入缸的側壁槽内，调节纸条使窄条1/2部分浸入推动液中，盖好盖子，于阴暗处展层约10min，即可在层析纸上分辨出4种不同的清楚色层。 3. 叶绿体理化性质的观察

荧光现象的观察取浓的叶绿体色素提取液化3ml，在透射光和反射光下观

察叶绿体色素提取液的颜色。

皂化作用在观察过荧光现象的叶绿体色素提取液中加入2ml的20%KOH-甲醇溶液，充分混匀。吹打5分钟；沿试管壁缓慢加入3ml乙醚+4ml的蒸馏水，边滴加边摇动，直至看到溶液逐渐分为两层为止。对照不加KOH-甲醇溶液。

叶绿素分子中Mg2+的取代作用取2只试管，分别加入2ml叶绿体色素提取液，第1只作为对照，第2只加入数滴5%HCl，摇匀，观察溶液颜色变化。当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，并微加热。与对照比较，观察溶液颜色变化，并解释原因。 五、 实验结果与分析

1. 叶绿体色素荧光现象的观察

叶绿体色素的透射光呈绿色，在反射光下呈深紫色。这是由于叶绿体色素主要吸收自然光中的红橙光和蓝紫光，未被吸收的光线透射过叶绿体色素溶液，呈现出绿色；在可见光下，叶绿体色素受激发，再从激发态跃迁到基态的过程中发出荧光，故其反射光为深紫色。（问题：在透过的光线中是否也参杂有叶绿体色素发出的荧光呢？是因为透射光强度很高而不能被观察到吗？） 2. 叶绿体色素的皂化反应

向2~3mL叶绿体色素溶液中滴加2ml的20%KOH-甲醇溶液后，溶液立即变为黄褐色，略有浑浊，不断震荡3min后溶液变澄清，颜色呈深黄绿色。

分析：对于这一现象，我们查阅相关资料后指导，向叶绿体色素溶液中氢氧化钾的甲醇溶液后，如不将此溶液立即混匀，则两种溶剂界面处的叶绿素分子会发生分子内的结构改变，可能是V环C10的氢原子转移到C9的氧原子上，形成了羟基，双键的位置则转移到C9与C10之间。正由于叶绿素分子的这种由酮式向烯醇式的变构,所以其颜色由绿色变为棕色。同时，C9的羟基又可与氢氧化钾发生反应而生成钾盐，颜色也呈棕色。1

V环

在实验和对照的两支试管中分别再加入3ml乙醚和4ml蒸馏水，两试管中溶液均分为两层，情况如下表： 实验组 对照组 上层颜色 黄褐色 绿色 下层颜色 绿色（与对照组绿色相无色 近） 上层高度：下层高度 约为1:4 约为1:1 分析：

实验组试管中，叶绿体色素中的叶绿素由于发生了皂化反应，生成了叶绿醇、甲醇和叶绿酸钾盐。类胡萝卜素和叶黄素分子结构中不含脂键，因此不发生酯化反应。无色的甲醇和叶绿醇（叶绿醇为无色或浅黄色油状液体。2）、呈橙黄色、黄色的胡萝卜素和叶黄素以及溶剂丙酮进入了以乙醚为溶剂的上层，使上层溶液呈黄褐色；而呈绿色的叶绿酸钾盐可溶于水，故下层水溶液呈绿色。

对照组试管中，上层为叶绿体色素与丙酮、乙醚的混合物，呈绿色，下层为水，呈无色。

但我们对上下层高度的比存有疑惑：对照组中加入了约2mL的叶绿体色素丙酮溶液、3ml乙醚和4ml蒸馏水，极性溶剂与非极性溶剂的体积比约为1：1；但实验组中加入了约2mL的叶绿体色素丙酮溶液、2mLKOH甲醇溶液、3ml乙醚和4ml蒸馏水，非极性溶剂与极性溶剂的比应接近7：4，至少上层液体应多于下层液体，但试验中上层液体明显少于下层，这个现象该如何解释呢？会不会是液体太多导致震荡时撒了出来？我们需要进一步验证。

3. 叶绿素分子中Mg2+的取代作用

向试管中的叶绿体色素溶液加入数滴5%的盐酸溶液后，溶液变为黄褐色。向试管中加入(CH3COO)2Cu粉末，并在沸水中水浴加热后，溶液变为深蓝绿色。

分析：

在弱酸性环境中，叶绿素中的Mg2+被H+取代，形成黄色的去镁叶绿素，溶液呈现黄褐色；加入(CH3COO)2Cu后，原来Mg2+被Cu2+取代，形成铜代叶绿素，溶液呈现蓝绿色。 如图2：

H+ Cu2+

4. 反应前后溶液光谱观察

皂化反应和取代反应结束后，我们用分光镜对各不同成分的溶液的光谱进行了观察，结果如下（由于手机的拍摄效果不理想，照片只作为参考）

溶液 自然光 光谱照片 光谱描述 分析 自然光的光谱呈— 现从红光到紫光完整的条带分布； 皂化反应上层 与自然光光谱相比，光谱中的蓝紫光条带几乎完全消失，但红橙光条带几乎不变； 皂化反应下层 与自然光相比，该光谱中红橙光和蓝紫光的条带均有明显减弱，但并未完全消失； 皂化反应上层溶液中的溶质成分主要为类胡萝卜素、甲醇和叶绿醇；其中类胡萝卜素吸收了自然光中的蓝紫光； 皂化反应下层中的溶质主要是叶绿酸钾盐，叶绿酸钾盐可以吸收自然光中的红橙光和蓝紫光，但吸收能力减弱；吸收能力的减弱是因为浓度的变化，还是分自结构的变化，需要进一步验证； 该层溶液主要是叶绿体色素的溶液，可以吸收自然光中的红橙光和蓝紫光，并且由于乙醚的稀释，吸收的光量少于原色素提取液，因此投过的光线较强； 该层主要时水，几乎不吸收自然光； 皂化反应对照上 …… 此处隐藏：2449字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……