qpcr步骤 - 图文

范围和适用性

本实验适用于使用StepOnePlus?实时PCR仪对DNA PE、DNA PE Index、SE文库以及Exon Capture组、转录组、表达谱、Small RNA组、表观遗传组等制备的文库进行上机前的精确定量。

摘 要

荧光定量PCR实验是以Agilent 2100 Bioanalyzer对文库的检测结果为参照, 使用StepOnePlus?实时PCR仪对文库进行定量,得出待测文库浓度，为之后的Cluster制备提供浓度依据。该实验的主要内容包括：（1）梯度稀释标准品；（2）按实验要求稀释样品；（3）配制反应预混液；（4）加样；（5）设置反应程序；（6）运行实验；（7）分析实验结果，计算待测样品浓度。整个流程需要3-4小时。

缩写词和SOP中专业术语的解释

缩写词或术语 基线(Baseline) C t 值 扩增曲线中的水平部分 扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环数。 解释 阈值(Threshold) 高于基线但处于扩增曲线的指数增长区范围之内的荧光水平。 实验材料及方法

1 实验试剂和耗材

1.1试剂

表1-1 实验所需试剂

试剂名称 10× Buffer dNTP(2.5mM) EX HS Taq TaqMan PE Probe PE Q-PCR Primer 1.1 Index Q-PCR Primer RR SE Q-PCR Primer 1.1 SE Q-PCR Primer 2.1 ROX 货号 DDR006B DDR006B DDR006B 12223－012 生产厂家 TAKARA TAKARA TAKARA 上海生工 上海生工 上海生工 上海生工 上海生工 Invitrogen NEB SIGMA 上海生工 SIGMA 上海生工 上海生工 含ThermoPol缓冲液B9004S MgSO4(100mM) Tween20 DMSO Betaine SRNA PCR Primer 1 SRNA PCR Primer 2 P9416-100ML DT0163-500ML B2629-1KG 1.2 耗材

表1-2 实验所需耗材

耗材 96孔国产光学反应板 光学封口膜（泛特津） 0.2ml Sterile, PCR microtubes 0.6ml离心管 吸嘴0.5-10ul超微量、袋装 吸嘴200ul黄色吸嘴、袋装 吸嘴1000ul蓝色、袋装 1.5ml离心管 型号 PCR-02D-C MCT-060-C T-300 T-200-Y T-1000-Y MCT-150-C 生产厂家 国产 国产 Axygen Axygen Axygen Axygen Axygen Axygen 2 实验仪器设备

表2-1 实验所需仪器设备

设备 StepOne Plus? Real-Time PCR System 迷你离心机 Vortex 微孔板离心机 型号 4376592 LX-200 QL－901 MPS-1000 ABI 生产厂家 海门其林贝尔 海门其林贝尔 Labnet 3 实验操作流程

3.1 填写Q-PCR实验登记表

样品的交接按照《质控组样品交接管理规程》执行。实验前，先在“表单准

备区”将要检测的样品在《Q-PCR实验登记表》中填写好，并根据“文库交接检测”文件夹中《____组文库检测结果》中的待测样品的顺序按顺序填到《Q-PCR实验登记表》上，并在右上角注明批次后打印出来。然后将需要检测的样品的样品名和文库号按照《Q-PCR实验登记表》上的顺序粘贴到“文库核对&存放位置”文件夹中的《文库检测前核对表》Excel表中，等待核对样品信息。 3.2 稀释标准品

开始实验前，到-20℃冰箱和冰柜中将实验所需的标准品和样品取出，并按Q-PCR实验登记表上的顺序排好，并到表单准备区，用扫描枪将样品的文库号扫描到“文库核对&存放位置”文件夹中的《文库检测前核对表》Excel表中进行核对，核对结果为“错错错错”，则样品不正确需重新找取样品信息相同的样品；核对结果为“对”，则样品正确。

核对完样品信息后，将样品和标准品拿到“稀释区”进行稀释。 名称 移液量 原管(1 nM) 超纯水(μl) 不稀释 终浓度(pM) Std 1 Std 2 Std 3 Std 4 Std 5 1000 100 10 1 0.1 2 μl (Std 1) 2 μl (Std 2) 2 μl (Std 3) 2 μl (Std 4) 18 18 18 18 1）取5个0.2 ml PCR 离心管，分别标记为Std 1、Std 2、Std 3、Std 4和Std 5。标准品多于一种时应标明标准品的名称。

2）分别吸取18 μl超纯水至Std 2、Std 3、Std 4和Std 5离心管。 3）使用新Tip移取2 μl Std 1至装有18 μl 超纯水的Std 2离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。 4）使用新Tip移取2 μl Std 2至装有18 μl 超纯水的Std 3离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。 5）使用新Tip移取2 μl Std 3至装有18 μl 超纯水的Std 4离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。 6）使用新Tip移取2 μl Std 4至装有18 μl 超纯水的Std 5离心管，用Vortex振荡10至15秒，用力用手甩离心管，将壁上的液体甩下。

7）将已稀释的标准品置于4 ℃或冰上。 【注意】

? 原管（1nM）的标准品要用时从-20 ℃冰箱中的标准品盒子中取出；不用

时应及时放回-20 ℃冰箱中，以防降解。

? 实验前带上口罩和新手套，并用70%酒精将实验台擦拭一遍。 ? 移液要准确，振荡要充分，振荡前需检查管盖是否盖严。 ? 使用超纯水稀释标准品。

3.3 稀释样品

1）如果待测文库是需要混合的Index文库，则先按照《Q-PCR pooling规则》混合好，贴好标签等待检测。

2）取和待测样品数量相同的0.6 ml PCR 离心管，分别标记为待测样品名称或者是样品管盖上的记号。

3）如果待测样品体积小于15ul（如表达谱、Small RNA组的样品），则分别吸取99 μl超纯水至每个离心管中；如果待测样品体积大于15ul，则分别吸取198 μl超纯水至每个离心管中。

4）将待测文库的样品原管充分振荡，短暂离心后，按照Q-PCR实验登记表上的顺序排好，然后分别移取样品溶液至相对应的装有超纯水的离心管中，如果样品体积小于15ul的，则吸取1ul的样品到装有99ul超纯水的离心管中；如果样品体积大于15ul，则吸取2ul样品到装有198ul超纯水的离心管中。振荡10至15秒，短暂离心。

5）将已稀释的样品置于4 ℃或冰上；将样品原管放回-20 ℃冰柜中的编号盒存放，将样品放到编号盒中腾空的位置，并将样品的文库号用扫描枪录入“文库核对&存放位置”文件夹中的《上机文库存放位置表》Excel表中的对应位置存档。

【注意】

? 移液要准确，振荡要充分，振荡前需检查管盖是否盖严，吸取样品后确

保管盖盖严。

? 使用的超纯水稀释样品。 3.4 配制反应预混液

1）到隔壁实验室的“Mix配制区”配制反应预混液。取1.5 ml或2 ml离心管，在管盖上标记上Mix，套上锡箔纸。

2）按以下反应体系准备反应预混液（以8个PE样品、1条标准曲线和10个SE样品、2条标准曲线为例）：

表3-4-1 PE Mix的配置

组分 1次反应所需用量（μl） 37次反应所需用量（μl）