显微镜的原理、构造、调试和使用(2)

库勒照明系统调整好以后，整个视域照明均匀，拍摄的显微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用过程中应特别注意：

a. 视场光阑不可任意开大，但可随物镜倍数的增大而将视场光阑收小，随物镜倍数的减小而开大； b. 聚光镜的高低位置不准乱调，否则会破坏已调整好的库勒照明系统； c. 使用10×以下物镜时要将聚光镜前端透镜摆出光路外，使用10×或10×以上物镜时要将前端透镜摆入光路中；

d. 关于物镜倍数与视场光阑大小配合问题，在实际使用过程中，作为一般观察不一定要收小或开大视场光阑，但作显微照相时，为了避免杂散光线对照相系统的干扰，以便能拍摄到较完善的照片，则应在使用每一个倍数的物镜时，把视场光阑调节到正好消失于所观察的视域边上，这是比较繁复的工作，但又非做不可。较为简便的方法是把与各个倍数物镜相对应的视场光阑事先调整好，并作好记号，以后使用时根据记号直接调至相应的位置。

(4) 孔径光阑的正确使用 由于聚光镜的孔径光阑可以影响显微镜的分辨率，使用时应掌握正确的使用方法。过去由于对孔径光阑的认识不足，往往把它当作是调节视野亮度的工具。虽然调节孔径光阑在一定程度上可以改变视野的亮度，但会直接影响成像的反差、对比度及分辨率，在使用过程中应尽可能避免。

为了发挥聚光镜孔径光阑的作用，以便在观察时，尤其在作显微照相时获得最佳分辨率，在每换用一个倍数的物镜时，在样品调焦清晰后，需要调节孔径光阑，使它的大小正好等于所用物镜数值孔径（物镜孔径像）的2/3 。

调整方法是用对中望远镜对焦于视野中黑色相差环上，调节孔径光阑，可以看到一个多边形的孔径光阑像，然后调到等于物镜孔径像的2/3，即介于黑色相差环外与圆形视域内之间。为方便起见，可把与各倍数物镜相对应的孔径光阑预先调整好，并作好标记，以免每次使用都要重新调整。 2. 显微镜成像光路系统的调整及显微镜检术概要 显微镜成像光路系统的调整，是根据不同显微镜检术的需要而进行的。所谓显微镜检术（microscopy），概括而言就是以显微镜观察样品时所使用的照明方法，以及如何使样品所成的像能获得更良好反差的技术与方法。以下简述显微镜检术中已成熟的几种方法及对应的显微镜成像光路系统的调整方法。

(1) 透射光明视野（brightfield） 这是自显微镜发明以来最传统、最普遍的应用方法。 基本部件：

a. 物镜：任何物镜都可作明视野观察；

b. 聚光镜：各种聚光镜均可，最好配有孔径光阑。

调整方法：在上述显微镜的库勒照明系统调整好后，即可应用明视野法。 适用范围：所有已染色的组织切片、血液涂片等。 注意事项：

a. 使用明视野方法观察时，一定要将库勒照明系统调整好； b. 视场光阑不可任意开大，使用10×、10×以下和10×以上物镜时，要将聚光镜前端透镜分别摆事实出和摆进光路中；

c. 不可用聚光镜的孔径光阑来调节视野的亮度，更不要乱调聚光镜的高低位置，否则，会降低显微镜的分辨率和破坏已调整好的库勒照明系统；

d. 作显微照相时，每换用一个倍数的物镜，就要调节聚光镜的孔径光阑，使它的大小正好等于所用物镜数值孔径的2/3 。

(2) 透射光相差法（phase-contrast） 这是现代显微镜检术中的一种反差增强法。

基本部件：相差物镜、明视野与相差兼用的多用途聚光镜、对中望远镜、绿色滤光片。 调整方法：

a. 在库勒照明系统调整好的基础上，用明视野方法把样品调焦清晰；

b. 把聚光镜转到Ph1对准转盘刻度线位置，选用10×相差物镜，换上待观察的透明样品；

c. 拔掉其中一个目镜，换上对中望远镜，并调焦于视野中的两个相差环上（物镜的黑色相差环和

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聚光镜的透光相差环）；

d. 视野中的两个相差环不一定重合，调节聚光镜上的两个调节装置（调整相差环左右位置的调节杆和调整前后位置的摩擦式转钮），使透光环作前后左右移动而与黑环重合；

e. 调整好后，换回观察用目镜，将绿色滤光片按入光路中，即可观察到样品的相差像； f. 有20×和40×物镜观察时，聚光镜应设在Ph2位置上，用100物镜时，聚光镜应设在Ph3位置上。

适用范围：适用于观察透明、未染色或不能染色的样品，如各种细胞、活组织、未染色或不染色的组织切片、水生生物等。

(3) 微分干涉相衬法（differential interference-contrast，DIC） 为了克服相差法观察时样品细节像周围伴随有光晕，会掩没掉本来应该看见的细节，以及样品或组织切片厚度要求相当薄，原则上下能厚于10?m等局限性，利用双光束干涉的原理设计子微分干涉相衬法。 调整方法

a. 必须在库勒明系统已调好的基础上才能调好DIC方法；

b. 先用10×物镜，以明视野先确定好能把样品看清晰的物镜调焦位置； c. 把起偏器（polarizer）摆入照明光路中，注意其取向应为东—西方向； d. 把聚光镜转盘转到与10×物镜对应使用的位置上，即DIC 0.3—0.4； e. 在物镜后方或物镜转换器上插入10×物镜使用的DIC插片（DIC slider）； f. 把检偏器（analyser）插入成像光路中，注意其取向应为南—北方；

g. 换上待观察的透明样品，开亮光源把样品调焦清晰；

h. 调节DIC插片，使微分干涉相衬的像达到最佳效果，也就是浮雕效果最为明显； i. 同时可调节聚光镜的孔径光阑，使反差的效果也达到最佳； j. 然后再细微调样品的细节，可见样品中不同层面上的结构；

k. 如果把补色器（first order red retardation plate）插入，并同时调节DIC插片，可在视野中看到不断变化的绚丽色彩，红、橙、黄、绿、蓝、紫、粉红、粉紫及金黄色都具有。适用范围：透明或不能染色的组织切片，厚度可达100?m左右，培养中的活组织和活细胞、小生生物等。

(4) 落射光激发的荧光法（incident-loght fluorescence Epi-FL） 简称为落射荧光法，是近代显微镜检术中新发展出来的一种强有力的反差增强法。它将激发荧光用的光源改在物镜的上方，光由物镜上方经反光镜射入物镜去激发样品，从样品上被激发的荧光经物镜成像并穿透反光镜而由目镜观察。该方法较简便，效率高，50W的光源强度比透射荧光法的250W还强。

荧光方法是利用波长较短的紫外光、紫光、蓝紫光、蓝光及绿光等去激发样品，只要样品中含有可产生荧光的成分，它便吸收短波的激发光而释放出波长较长的荧光。不同物质只能吸改特定波长的激发光，而释放的荧光也会有特定的波长，因而用作特异性的鉴定十分有效，如某些致病的细菌和螺旋体，受紫外光激发后能发出它们特有的荧光，很容易作出鉴定，这种利用物质吸收激发光后放出特有荧光的方法称为自发荧光法。某些物质自身不会吸收激发光，或吸收后不能释放荧光，但可以吸收或吸附特定的荧光色素或染料，而这些特定的荧光色素或染料也只能吸收特定的激发光，再释放出特定的荧光，从而间接地鉴别出某种物质，这称为间接荧光法。上述荧光方法广泛应用于医学、生物学及工业的特异性研究和鉴别上。

调整方法：荧光显微镜或附有荧光部件的显微镜，调整的方法大致相同。 ① 汞灯的安装

a. 打开包装，取出汞灯将其小心安装在上电极散热帽上，安装时注意手指不能直接接触灯管和散热帽的正面，汞灯的封气口要对向散热帽的左侧或右侧；

b. 把汞灯的上电极引张安装并固定在散热帽底面的小孔上，再 …… 此处隐藏：3455字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……