骨髓间充质干细胞条件培养液对心脏成纤维细胞的影响

骨髓间充质干细胞条件培养液对心脏成纤维细胞的影响

姜振宇许颖姚程宋晓燕（吉林大学第一医院血液科，吉林长春１３００２１）

（摘要］目的探讨体外２％氧条件下培养骨髓间充质干细胞（ｍｅｓｅｎｅｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ，ＭＳＣｓ）培养液对成年大鼠心肌成纤维细胞增殖及胶原合成情况的影响。方法分离Ｗｉｓｔａｒ大鼠下肢骨获取ＭＳＣｓ进行培养，收集培养３、６、９、２４ｈ培养液，用其刺激成年Ｗｉｓｔａｒ大鼠的心肌成纤维细胞３０ｈ，采用ＭｒＩＴＩ’法和３Ｈ一脯氨酸掺入法检测心肌成纤维细胞的增殖及胶原合成情况。结果经３、６、９ｈ的ＭＳＣｓ条件培养液刺激后的心肌成纤维细胞３Ｈ－脯氨酸掺入量与无血清对照组比较显著增加，分别增加２３％（Ｐ＜Ｏ．０１）、４４％（Ｐ＜０．０１）和３１％（Ｐ＜０．０１），而２４ｈ组与无血清对照组比较差异无显著性；ＭＳＣｓ条件培养液刺激后的心肌成纤维细胞Ｍｒｒｒ结果与对照组比较差异无显著性。结论ＭＳＣｓ低氧条件培养液可以促进心肌成纤维细胞胶原合成，改善心功能。

［关键词】骨髓间充质干细胞；心脏成纤维细胞；胶原

［中图分类号］飚４３（文献标识码］Ａ［文章编号】１００５－９２０２（２００７）０９＿０８１２ｍ３

Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍｏｆｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｏｎｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ

ＪＩＡＮＧＺｈｅｎ－Ｙｕ，ＸＵＹｉｎｇ，ＹＡＯＣｈｅｎｇ，ｅｔａ１．

ＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙＤｅｐａｒｔｍｅｎｔ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＪｉＨｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｊｉｌｉｎ，Ｃｈｉｎａ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ｏｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌ（ＭＳＣ）ｍｅｄｉａｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏ．ｂｌａｓｔｓ（ＣＦＢｓ）ａｎｄｃｏｌｌａｇｅｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｉｎａｄｕｌｔｒａｔｓｂｙｍｉｍｉｃｋｉｎｇｈｙｐｏｘｉａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｖｉｔｒｏ．ＭｅｔｈｏｄｓＭＳＯｓｏｂｔｍｎｅｄｆｒｏｍｂｏｎｅｓｏｆｌｏｗｅｒｌｉｍｂｏｆＷｉｓｔａｒｒａｔｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｔｏｃｏｌｌｅｃｔｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅｆｌｕｉｄａｔｔｈｅ３ｒｄ．６ｔｈ．９ｔｈａｎｄ２４ｔｈｈｏｕｒ．ＣｕｌｔｕｒｅｄＣＦＢｓｏｆｒａｔｗｅｌ＇ｅｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙｔｈｅａｂｏｖｅＭＳＣ．ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉａｆｏｒ３０ｈｏｕｒｓｔｏｄｅｔｅｃｔｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆＣＦＢｓａｎｄｃｏｌｌａｇｅｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｂｙＭＴＴａｎｄ’Ｈ．ｐｒｏｌｉｎｅｉｎｃｏｒｐｏｒａ－ｔｉｏｎ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎｏｆ’Ｈ—ｐｒｏｌｉｎｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｉｎＭＳＣ。ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉａａｔｔｈｅ３ｒｄ．６ｔｈａｎｄ９ｔｈｈｏｕｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ２３％，４４％ａｎｄ３１％（ａｌｌＰ＜０．０１），ｗｈｉｌｅｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎＭＳＣ．ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉａ

ｇｒｏｕｐａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．ＴｈｅＭＴｒｒｅｓｕｌｔｓｏｆＣＦＢｓｓｔｉｍｕｌａｔｅｄｂｙＭＳＣ．ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉａ

ｇｒｏｕｐ

ｄｉｄｎ’ｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｆｒｏｍｔｈａｔｏｆｃｏｎｔｒｏｌ

ｇｒｏｕｐ．ＣｏｎｃｌｕｓｉｏｎｓＭＳＣ．ｈｙｐｏｘｉａｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉａｃｏｕｌｄｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｃｏｌｌａｇｅｎｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆＣＦＢｓｔｏｉｍｐｒｏｖｅｔｈｅｃａｒｄｉａｃｆｕｎｃｔｉｏｎ．【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ＭＳＣｓ）：Ｃａｒｄｉａｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ：ＣｏＨａｇｅｎ

已证实干细胞心肌移植已成为心力衰竭治疗的新途径¨’２ｏ。多数学者认为，骨髓间充质干细胞（ＭＳＣｓ）具有多向分化潜能，在一定条件下可以分化为软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞和心肌细胞等＂。ｏ。同时有学者研究发现，骨髓基质细胞可促进血管生成，并认为在血管生成的过程中，起关键作用的可能是干细胞分泌的细胞因子∞Ｊ。目前国内外对于ＭＳＣｓ移植心肌缺血区后其旁分泌途径的研究较少，本研究对此领域做一初步探讨，为临床应用提供理论依据和技术支持。

１材料与方法

１．１试剂及仪器ＤＭＥＭ、新生小牛血清、胰蛋白酶（１：２５０）购自ｈｙｃｌｏｎｅ公司；四氮唑盐（ＭｒＩＴ）和二甲基亚砜（ＤＭＳＯ）购自Ｓｉｇｍａ公司；３Ｈ－脯氨酸购自中国原子能研究院同位素研究所；ＣＯ：孵箱（为可调氧浓度的ＣＯ：孵箱）。

１．２ＭＳＣｓ分离培养雌雄不拘Ｗｉｓｔａｒ大鼠（８０４－５）ｇ，麻醉、抗凝，无菌条件下剥离大鼠股骨和胫骨，经ＰＢＳ漂洗用含１５％血清的ＤＭＥＭ培养液冲洗骨髓腔，细胞悬液接种于培养瓶中置于３７℃，５％ＣＯ：孵箱中培养。实验采用第２—５代细胞。

基金项目：吉林省科技厅资助项目（２００５０５２０２）

通讯作者：姚程（１９５６一），男，教授，主要从事肿瘤临床研究。

作者简介：姜｛）ｌ乏’乒（１９５８一），女，教授，主要从事肿瘤及白血病临床研究。１．３心脏成纤维细胞分离培养雄性Ｗｉｓｔａｒ大鼠（２００±

１０）ｇ，麻醉、抗凝，无菌条件下手术开胸取心脏。经ＰＢＳ冲洗后，分离去除心房和大血管，将心室剪碎，于恒温水浴振荡器中３７℃振摇消化（１５０次／ｍｉｎ），消化液为含０．１％胰酶和０．１％胶原酶的ＤＭＥＭ）１０ｍｉｎ，吸取收集消化所得的细胞悬液，剩余的

组织块另加消化液再次消化，如此重复７次。收集第２—８次消化所得的细胞悬液至离心管，加入等量的含２０％新生小牛血

清的ＤＭＥＭ，离心（１０００ｒ／ｍｉｎ，ｌＯｍｉｎ）、弃上清，加入含２０％新生小牛血清的ＤＭＥＭ吹打成细胞悬液后过筛（３６０目）、再次离心、弃上清，加入含２０％新生小牛血清ＤＭＥＭ吹打成悬液、接

种至６孔培养板，于ＣＯ：孵箱中３７。Ｃ、５％Ｃ０２、９５％湿度孵育３０ｒａｉｎ后ＰＢＳ轻柔冲洗、换液，以后每２ｄ换液１次。常规培养、传代，取第２代细胞进行实验‘７．８１。

１．４ＭＳＣｓ条件培养液的收集培养第２～５代ＭＳＣｓ用ＰＢＳ漂洗２次，去除残留的完全培养基，加入不含胎牛血清的

ＤＭＥＭ培养液，然后将细胞置于可调氧浓度的培养箱，２％Ｏ：，无菌条件下收集３…６９２４ｈ的培养液，置一７０。Ｃ冻存备用。

１．５采用３Ｈ－脯氨酸掺入试验测定心脏成纤维细胞胶原合成功能对数生长期心脏成纤维细胞接种在９６孔板中，５×１０３个细胞／孔，３７℃、５％ＣＯ：及饱和湿度下培养至细胞接近汇合。弃上清，加入含１％血清的ＤＭＥＭ继续培养２４ｈ，使细胞进入生长静止期。分别加入ＭＳＣｓ条件培养液１００ｉ，１，３Ｈ．脯氨酸

姜拯芏笠盟焦回五厦士塑厘釜住 …… 此处隐藏：6102字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……