中药指纹图谱制定的方法学探讨

中药指纹图谱制定的方法学探讨屠鹏飞

(北京大学药学院，北京108 ) 003

中药材绝大部分来源于生物，包括植物药和动物药。现有研究表明，中药活性成分大部分为生物体内次 生代谢产物，少数为初生代谢产物。生物体由于受产地、气候、生态环境、栽培或养殖技术条件等因素影响，相同种类的生物体，其体内的代谢产物往往有一定的区别，有些有明显的差异，而且大部分中药材需要经炮制、加工后再入药，不同的炮制、加工方法对中药材的成分也有明显的影响，由此造成中药材的质量不稳定。对

中药材的活性成分研究虽然已进行了半个多世纪，但大部分中药的有效成分未被阐明或仅部分阐明，因此对中药材或中成药的某个有效成分或指标性成分进行定性、定量分析，仍不能有效地控制中药材或中成药的质量。中药化学指纹图谱 ( 简称中药指纹图谱)是指某种 (或某产地)中药材或中成药经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材或中成药特性的色谱或光谱的图谱。其特点在于： (通过指纹图 ) 1谱的特征性，能有效鉴别样品的真伪或产地； (通过指纹图谱主要特征峰的面积或比例的制定，能有效控 ) 2制产品的质量，确保产品质量的相对稳定。因此，在有效成分不完全明确的前提下，制定中药材或中成药的指纹图谱，对于有效地控制中药材或中成药的质量，具有重要的意义。目前指纹图谱己成为国际公认的控制中药或天然药物质量的最有效的手段。中药指纹图谱的研究与应用我国刚刚起步，各研究单位都处于探索阶段，本文根据我们指纹图潜研究的初浅经验，探讨中药指纹图谱制定的一些方法学问题。

一中药材指纹图谱的制定中药材大部分来源于生物，其化学成分受种类、产地、生态环境、土壤、气候、栽培、加工技术的影响较 大。因此，制定指纹图谱时必须考察上述各种因素对指纹图谱的影响，从而归纳出合格药材的特征指纹图谱。

1多来源中药材的不同品种的指纹图谱考察 目《 前中国药典》收载的中药材有很多品种是属于多来源品种。有些是同属的数种植物或同属的所有植

物，药如中大黄的植物括黄属的大黄 h m a a L唐古大 R匆9t mM i. B f原包大掌叶 Re pl t . u m u、特黄 .月“ u am e a m c i x x l .和药用大黄 . ca B l蒲公英的原植物则为同各种植物。 R o il a . i f ne i, l属的有

些是同科不同数种植物，属的甚至是不同科的数种植物，如中药山慈菇的原植物包括兰科的杜鹃兰属C m t和独蒜兰属尸召 e沁 ar sa 2o的数种植物，小 i n

通草的原植物则包括族节花科族节花属 c“ a t S彻二和山茱英科的青荚叶 l ij oi (l .De。同 e i护 a ln Hw a汇nc Tu )i t属 g n b . r不同品种的中药材，一般来说，其指纹图谱均有一定的差别，如中药肉从蓉，目前商品药材包括肉从蓉

sn。 t o i a几 e rca a盐生肉 .s ac^ M丫 G Bc c t c d eilM、 s从蓉c a (. . e) .e和管花肉 . t u as e ) gt三 s l k从蓉c u l ( h W h bo c n i, s k者指纹图谱有一定的差别 (见图1 )。不同科、属的多来源品种，其指纹图谱差别更大。在制定多来源中药￣3材的指纹图谱时，必须先鉴定药材品种，各品种分别研究其指纹图谱，通过比较、分析，找出各品种之间指纹

图谱的共性与特性，采用其共性指纹标定该类药材的质量，特性指纹标定药材的品种和该品种药材的质量。因此，对于多来源的中药材，必须考察不同品种的指纹图谱。

2不同产地中药材指纹图谱的考察 中药材的产地对指纹图谱也有较大的影响，如我们在研究黄茂的指纹图谱中发现，山西栽培的蒙古黄茂 与内蒙古栽培的蒙古黄茂，其指纹图谱有一定的区别：而同是内蒙古产的蒙古黄茂，各旗所产的药材，其指纹图谱也有一定的区别。所以在制定中药材指纹图谱的标准时，必须对各主要产地的指纹图谱进行考察，分析各产地之间指纹图谱的共性与特性。11 1

3不同采收期中药材指纹图谱的考察 中药材一般都有固定的采收时间，如根类、根茎类药材一般在秋天或春天采挖，花类药材一般在花蕾期

采集，果实、种子类药材在果实或即成熟将成熟期采集，但部分药材采收时间跨度较大，如有些根类、根茎类药材，既可以春天采集，也可以秋天采集，木类或皮类药材全年都可以采集。一般来说，采集时间固定 (一2 l个月)的中药材，其指纹图谱变化不明显，采集时间跨度较大的中药材，其指纹图谱往往有较明显的差别。因

此，对采集时间跨度较大的中药材，应考察不同采集时间的指纹图谱，分析采集时间对图谱的影响。 4产地加工和炮制方法对指纹图谱的影响 简单的产地加工和炮制方法，如快速水洗、蒸、润等， 对指纹图谱没有

明显的影响，但如采用特殊的炮制方法如炒炭、醋制等，则对指纹图谱有明显的影响。因此对于采用特殊炮制方法炮制的中药材，同时应考察不同炮制方法的指纹图谱的变化。 5《 中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行)》呼唤中药材生产GP A的实施。

国家药品 监督管理局颁发的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求 (暂行)》 (国药管注【 0」号 2 04 0 3 8)对注射剂用中药材指纹图谱制定的各项技术要求作了明确的规定。由于中药注射剂的特殊性，其指纹图谱的各项要求都很高，根据我们的实践经验，采用野生中药材或非规范化栽培的中药材，较难达到其技术要求，但

采用规范化栽培技术生产的中药材，其指纹图谱一致性较强，较易达到要求，如黄茂，我们考察了2多批样品 0的皂昔类和黄酮类成分的指纹图谱，其中1批是美国泛华医药公司在内蒙古的栽培基地按G P 2 A要求生产的药材

,其指纹图谱的一致性很强，符合《技术要求),而其他8 )批同是内蒙古产，但非栽培基地的样品，其指纹图谱就难以达到要求。因此，该《技术要求》的实施将有效地促进中药材生产G P A的实施。

6供试品的取样方法由 于生物样品个体之间的差异性，导致各个体化学成分有一定的变化。因此，供试品的取样除按《中国药典》20年版中规定的中药材的 00取样方法执行外，尚应有一定的量，以保证供试品的代表性和均一性。二中成药指纹图谱的制定中成药系指以中药材为原料生产的各种中药制剂，包括单方、复方制剂和以有效部位或单体化合物投料的 各种制剂。由于中药材质量和中成药生产工艺的不稳定，造成中成药质量的不稳定。目前我国中成药的质量控

制很不完善，如复方中成药一般仅对其中的某一有效成分或指标性成分进行定量控制，对其他部分药味进行定性控制，少数连定量控制都没有。使用劣质药材或偷工减料，都难以在质量检验中发现。因此，采用指纹图谱控制中成药的质量，对于单方、复方和以有效部位投料的中成药的质量提高有着重要的意义。

1质量稳定的中药材是生产指纹图谱稳定的中成药的前提 中药材的质量直接关系到中成药的质量，因此采用指纹图谱控制中成药的质量，其所用的中药材也必 须采用指纹图谱控制质量。

2工艺稳定是生产指纹图谱稳定的中成药的重要环节 用于制定中成药指纹图谱的供试品必须是生产工艺稳定后的产品，同时应考察1批以上

连续生产的产 0

品的指纹图谱，以确定生产工艺的稳定性。3标准提取物投料是生产指纹图谱稳定的中成药的有效途径 由于中药材化学成分的多变性和中药生产工艺的复杂性，要生产质量稳定的中成药难度很大，采用质 量稳定的标准提取物投料，将有效地解决中成药的质量问题，从而确保中成药指纹图谱的一致性。

三检测方法适宜的检测方法，是制定合格指纹图谱的重要环节。从理论上说，色谱方法和光谱、波谱方法均可用

于制定指纹图谱。根据我们的经验，挥发性成分，采用气相色谱检测，较易达到要求；非挥发性成分采用高效

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液相色谱检测，较易达到要求。对于一些成分简单，在薄层色谱上分离度较好的供试品，采用薄层扫描，也能

达到要求。而光谱方法如紫外光谱和红外光谱，由于提供信息较少或同类化合物，其取代基的变化，难以在光谱中体现出来，因此采用光谱方法制定指纹图谱，其专一性不强，不能充分反映供试品中的成分变化，如黄茂的红外光谱，不同品种、不同产地黄茂的红外光谱几乎没有区别，大黄的紫外光谱，各组的不同品种之间区别也很少。因此，建议优先采用色谱方法制定指纹图谱。四参照物的设立与选择为了确保指纹图谱的重现性，制定指纹图谱应设立参照物。应尽量选择对照品作为参照物，既可以作为相 对保留时间计算的参照物，又可以作为峰面积比值计算的参照物，同时又能初步了解指纹图谱中各色谱峰成分的性质。而采用内标物作为参照物，由于指纹图谱色谱峰的复杂性，较难选择合适的内标物插入图谱中。

五采用色谱方法建立指纹图谱的方法学考察用于中药质量控制的指纹图谱必须具备特异性、重现性和再现性。为此，必须进行严格的方法学考察。

1样品处理方法考察 样品处理包括：样品提取方法、提取溶剂、纯化方法等考察。应选择提取率高、操作简便的提取、纯化方 法。在选定提取、纯化方法后，必须考察1份以上同一批号的样品，要求1份样品的指纹图谱完全一致，主要 0 0

色谱峰面积的R D不得大于5 S%%。2特征指纹图谱确定 对于所含成分类型相同或相似的中药材或中成药，可以采用一张指纹图谱。对于所含成分类型较多的中药 材或中成药 (尤其是复方制剂),应根据所含成分类型，制作多张指纹图谱。

确定特征指纹图谱必须具有充分的代表性和特异性，至少对1个产地以上不同等级的样品进行分析，或对

0同一产地不同规格的1批以 0上的样品进行考察，从中归纳出各批合格样品所共有的、峰面积相对稳定的色谱峰作为指纹峰。所选取色谱峰的组合必须具备特异性，对于原药材多来源的品种，必须考察种间的特异性。 3指纹图谱的精密度考察 将同一份样品，连续进样5 次，所得特征指纹图谱的主要色谱峰的峰面积的R D S%不得大于5%,各色谱峰的相对保留时间或R应基本一致。由于保留时间受洗脱溶剂、色谱柱、温度等因素影响较大，为此每张色谱灌图必须采用一个对照品或内标物进行对照，调节色谱峰的保留时间或R直列。

4指纹图谱的重现性考察 取5 份样品，按测定方法测定，所得指纹图谱的主要色谱峰峰面积的R D S%不得大于5%,各色谱峰的相对保留时间或R值应基本一致。 f 5指纹图谱的稳定性考察

取同一份样品，分别在0,2,8 2,2,3,4小时测定，以 ,1,4,1 4 6 8特征指纹图谱峰面积和相对保留时间为指标，考察样品的稳定性。确证主要特征指纹的化合物结构

作为指纹图谱的研究，在条件许可的前提下，应尽量采用对照品对照或化合物的分离、鉴定，鉴定主要特征指纹的化合物结构，提高指纹图谱的可信度。供试品指纹图谱的合格性判断 目前判断供试品指纹图谱的合格性主要采用特征指纹的出现率和主要特征指纹的峰面积比值的变化，该方法有一定的可操作性，但尚缺少客观性和科学性。应建立指纹图谱的计算机模拟识别系统，评价指纹图谱的相关性，以相关率判断供试品合格与否。

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六确证主要特征指纹的化合物结构

作为指纹图 谱的研究，在条件许可的前提下，应尽量采用对照品对照或化合物的分离、鉴定，鉴定主要特征指纹的化合物结构，提高指纹图谱的可信度。

七供试品指纹图谱的合格性判断目 前判断供试品指纹图谱的合格性主要采用特征指纹的出现率和主要特征指纹的峰面积比值的变化，该方法有一定的可操作性，但尚缺少客观性和科学性。应建立指纹图谱的计算机模拟识别系统，评价指纹图谱的相关性，以相关率判断供试品合格与否。