农杆菌的培养与感受态制备

农杆菌感受态的制备与转化

实验室根癌农杆菌感受态的制备：

1. 取保存于-70°LBA4404菌株在YEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或平板活化，挑取单菌落接种于5mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或YEP(含50mg/l利福平)液体培养基中，28°C、200rpm培养24-28h。

2. 取2ml菌液接种至50mlYEB（含125µg/ml链霉素或50mg/l利福平）或利福平)中，28°C、200rpm培养至OD600≈0.5左右。

3. 菌液冰浴30min后，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。

4. 弃上清，用10ml 0.15mol/l Nacl重悬菌体，4°C、8000rpm离心10min收集菌液。 5. 弃上清，用2ml 20m mol/l Cacl2重悬菌体，加入1ml60%无菌甘油(使其终浓度为20%），

每管100μl分装，液氮冻存，-70°C保存。

重组质粒电转入农杆菌中：

1. 从大肠杆菌中提取重组质粒，将5μl重组质粒加入农杆菌感受态中，至于冰上30min。 2. 将混合物加入电击杯中，选择“Agr”模式（电压2.2kv，时间4.9ms）电击，加入800

μl YEB培养基，28°C、200rpm振荡培养3-5h，8000rpm离心30S（实际操作中不离心，吸取菌液50、100、150ul等多做几个梯度，用无菌水稀释至180ul），弃上清，涂布于YEB平板（含农杆菌和质粒所带抗生素，如Kan和利福平）。 3. 28°C恒温箱中倒置培养48h（24h以上）。

4. 从农杆菌中提取质粒，双酶切，琼脂糖凝胶电泳检测；扩目的片段并测序验证。 5. 转化烟草等实验材料。

YEB培养基：

1. 0.5%（w/v）蔗糖，0.1%（w/v）细菌用酵母提取物，1%（w/v）细菌用胰蛋白胨，0.05%（w/v）MgSO4·7H2O，调节pH7.0，121°C灭菌15min。 2. 固体加入1.5%的琼脂粉（100ml加1.5g）。

3. 加所需抗生素，如Kan+ ，利福平，链霉素。

农杆菌感受态制备：

1）活化原始农杆菌AGL-1菌株于YEB（含50µg/ml羧苄青霉素）平板上，28°C下倒置培养约2d； 2）从上述平板上挑单菌落于约5mlYEB液体培养基内（含50µg/ml羧苄青霉素），于200rpm、28°C振荡培养过夜；

3）吸取1~2ml培养菌液接种到100mlYEB（含50µg/ml羧苄青霉素）中，于200rpm、28°C摇床培养至OD660≈0.5；

4）5000rpm，4°C下离心5min，去上清液，用20ml冰预冷的10%（v/v）甘油重悬菌体，此步骤重复两次；

5）5000rpm，4°C下离心5min，去上清液，用1ml冰预冷的10%（v/v）甘油重悬，每管40µl分装于1.5ml灭菌离心管中，液氮速冻后保存于 80°C备用。

农杆菌电击转化：

用电击法将载体质粒导入根癌农杆菌AGL-1的具体操作为：将5~50ng质粒DNA加入冰浴解冻的农杆菌感受态细胞中混匀，然后转入冰预冷的电击杯中，将其置于电转化仪（Bio-Rad）中脉冲8~12ms。将电击后的农杆菌转入1mlYEB中，于28°C，200rpm摇床培养2~4hr后，5000rpm离心5min收集菌体，弃大部分上清液，用余下液体重悬菌体，混匀后涂布在含相应抗生素（如卡那霉素和羧苄青霉素）的YEB平板上，28°C恒温箱中倒置培养2d左右至抗性菌落出现。