DNA提取及常见问题分析

DNA提取及常见问题分析

内容第一部分：DNA提取方法简介 第二部分：DNA提取常见问题、 原因分析及其对策

前言DNA是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因 此DNA的提取是分子生物学实验技术中最重要、 最基本的操作 。

DNA提取的几种方法

染色体DNA的提取CTAB法 SDS法

其它

DNA提取的几种方法 非染色体DNA的提取 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法

线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法

基因组DNA- CTAB法

CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基 溴化铵),是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。

注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的

植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。

基因组DNA- CTAB法

CTAB提取缓冲液的经典配方组份终浓度

Tris-HCl EDTA NaCl (pH8.0) (pH8.0)100 mM 20 mM 1.4M

CTAB2%(W/V)

β-巯基乙醇 0.1%(V/V) 使用前加入

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；

EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；

β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除

基因组DNA- CTAB法 CTAB提取缓冲液的改进配方组份 终浓度 Tris-HCl EDTA NaCl (pH8.0) (pH8.0) 100 mM 20 mM 1.4M CTAB PVP40 β-巯基乙醇 2%(V/V) 使用前加入

3%(W/V) 5%(W/V)

PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。

基因组DNA- CTAB法 CTAB法流程图裂解液酒精沉淀

植物材料

液氮研磨

抽提

离心洗涤

DNA溶液

细胞裂解

上层溶液

干燥溶解

基因组DNA-SDS法 SDS法原理 SDS是一种阴离子去垢剂，在高温(55~65℃)条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸； 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀； 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。

SDS法DNA提取缓冲液组份 Tris-HCl EDTA (pH8.0) (pH 8.0 ) NaCl SDS

终浓度

10 mM

20 mM

0.4M

2%

基因组DNA-SDS法 SDS法流程图 (以动物组织为

例)动物组织抽提 离心洗涤

组织匀浆

上层溶液

干燥溶解

细胞裂解

酒精沉淀

DNA溶液

基因组DNA-其它方法

根据细胞裂解方式的不同有：物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 生物方式：酶法

基因组DNA-其它方法

根据核酸分离纯化方式的不同有：吸附材料结合法：硅质材料高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。

阴离子交换树脂

低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。

磁珠

磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。

基因组DNA-其它方法 浓盐法：利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离

有机溶剂抽提法：有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用

密度梯度离心法：利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物

质粒DNA-碱裂解法 碱裂解法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。

质粒DNA-碱裂解法 碱裂解法流程图对数期菌体 上清液 沉淀

溶液I充分重悬

抽提

干燥溶解

溶液II裂解

酒精沉淀

质粒DNA溶液

溶液III中和

离心洗涤

质粒DNA-煮沸法 煮沸法原理 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子； 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象； 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。

细胞器DNA-差速离心法线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。

差速离心法原理

是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质(蔗糖)中，以一定的转速进 行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。

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