3 实验二 细菌的简单染色

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实验二 细菌的简单染色及革 兰氏染色

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实验目的1、掌握细菌染色的原理 2、掌握细菌简单染色和革兰氏方法

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实验原理---单染色1、用于生物染色的染料的碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷 的物质结合。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结 合。 2、因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶 液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料(如美蓝、结晶紫、 碱性复红或孔雀绿等)使其着色。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚 果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料， 如伊红美蓝、伊红天青等。

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实验原理---革兰氏染色

该染色法能将细菌分为G+菌和G-菌，是由这两类菌的细胞壁结构 和成分的不同所决定的。 G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层 较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁 的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就 被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且 交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔 径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。

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实验器材1、材料 大肠杆菌；金黄色葡萄球菌 2、试剂或染液 草酸铵结晶紫；碘液；95%乙醇；复红溶液； 蒸馏水 3、其他 载玻片；接种环；酒精灯；打火机；卫生纸；酒精棉球

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实验步骤1、简单染色： (1)涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无 菌操作法取菌涂片，左边涂金黄色葡萄球菌，右边涂大肠杆菌，做成浓 菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑2-3环涂在 左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取2-3环涂在右边制成薄涂面。 亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。 (2)晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。

(3)固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定(以不烫手 为宜)

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实验步骤(4)染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色1-2min。 (5)水洗：用水洗去涂片上的染色液 (6)干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干。 (7)镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转 出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的 形态。

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实验步骤2、革兰氏染色： (1)涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。 (2)晾干：与简单染色法相同。 (3)固定，与简单染色

法相同 (4)结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量(以盖满细菌 涂面)的结晶紫染色液染色1分钟。 (5)水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。 (6)媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染1min。 (7)水洗：用水洗去碘液。 (8)脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色20—25s至流出液无色，立 即水洗。

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实验步骤(10)水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 (11)晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。 (12)镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判 断菌体的革兰氏染色反应性。 (13)实验完毕后的处理：

①将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上 的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦2—3次。c.再用干 净的擦镜纸将镜头擦2—3次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。 ②看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。

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实验作业

绘出金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆 菌的形态图，并注明两菌的革兰氏染色的反应 性