实验六 胰蛋白酶活力的测定

实验六 胰蛋白酶活力的测定

(先打开水浴锅,温度设置成40摄氏度) 一、实验目的 二、实验原理 三、器材仪器和主要试剂 四、实验操作 五、思考题

一、实验目的

掌握定量测定蛋白酶的活性的方法，了解本 实验的酶、底物和生成物的相关性质，以及本 反应的环境条件。 进一步理解酶活力和比活力的概念 巩固比色法测定物质含量的基础,掌握721型分 光光度计的原理和使用方法,学习绘制标准曲线 的方法

二、实验原理

1.胰蛋白酶是一种水解酶，它将酪蛋白水解成酪氨 酸等物质。 2.所生成的酪氨酸能与酚试剂反应成蓝色物质.酚 试剂又名Folin试剂，是磷钨酸和磷钼酸的混合物， 它在碱性条件下极不稳定，可被酚类化合物还原产 生蓝色(钼蓝和钨蓝的混合物,680nm) 3.用分光光度计可以定量的比较颜色的深浅，从而 推导出酪氨酸的量，根据生成物的含量可以计算胰 蛋白酶的活力。 4.蛋白酶活力单位定义：在40 C,pH7.5的条件下， 水解酪蛋白每分钟产生1 g酪氨酸为1U。

三、器材仪器和主要试剂

721 型分光光度计 Folin 试剂甲液，乙液 0.5% 酪蛋白 100 μ g/mL Tyr 溶液

四、实验操作 管号

1、酪氨酸标准曲线的制作1 2 3 4 5 6 样品

Tyr 100 g/ml(ml)水(ml) 稀释后Ty(μg/ml) Na2CO3(ml)

01.0 0 5

0.20.8 20 5

0.40.6 40 5

0.60.4 60 5

0.80.2 80 5

1.00 100 5

酚试剂(ml)A680nm

1调0

1

1

1

1

1

迅速混合，于40℃放置15分钟

以酪氨酸浓度μg/ml数为横坐标， A680nm为纵坐标，作出标准曲线。

2、蛋白酶活力的测定管号 酶液 (ml) 酪蛋白 三氯 (ml) 醋酸 (ml) 2 ------3 40℃水 浴准确 保温10 分钟 三氯 醋酸 (ml) 3 -----酪蛋白 40℃水浴保 (ml) 温10分钟， 过滤得滤液 ------2 1号(样 品) 2号(对 照) 1 1

胰酶活力单位定义：规定在 40 ℃ , pH7.5 的条件下，水解酪蛋白每分钟 产生酪氨酸 1 微克为一个酶活力单位。1g 蛋白酶在 37 ℃ , pH7.5 的条件下所具备的总活力单位为： ( A 样 — A 对 )× K × V/t × N A 样 ：样品液光吸收值； A 对 ：对照液光吸收值； K :标准曲线上光吸收为 1 时的酪氨酸微克数； t :酶促反应的时间(分),本实验 t =10 ; V :酶促反应管的总体积(毫升数),本实验 V =6 ; N :本次实验酶液的稀释倍数:2000

五、思考题

酶的试验为何设对照又要设空白 稀释的酶溶液是否可长期使用？说明原 因。 如何保证本实验测定数据的准确性？