枯草芽孢杆菌产淀粉酶试验

枯草芽孢杆菌产α-淀粉酶发酵试验

化学与生命科学学院

摘要：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658）为实验菌株，通过种子扩大培养，选出生长力旺盛的菌株进行液体摇瓶发酵。通过测定不同发酵时间生产的酶活，来初步估计发酵最佳时期和终点。

关键词：枯草芽孢杆菌，α-淀粉酶，液体摇瓶发酵，酶活

淀粉酶是能够分解淀粉糖苷键的一类酶的总称，包括α-淀粉酶、β-淀粉

酶、糖化酶和异淀粉酶。芽孢杆菌主要用来产生α-淀粉酶和异淀粉酶，其中α-淀粉酶又称淀粉1，4-糊精酶，能够切开淀粉链内部的α-1，4-糖苷键，将淀粉水解为麦芽糖、含有6 个葡萄糖单位的寡糖和带有支链的寡糖；而异淀粉酶又称淀粉α-1，6-葡萄糖苷酶、分枝酶，此酶作用于支链淀粉分子分枝点处的α-1，6-糖苷键，将支链淀粉的整个侧链切下变成直链淀粉。通过发酵实验，我们可以以酶活为依据，初步估计发酵的最佳时期和发酵终点。

实验材料和方法

一、实验材料：

（一）实验菌株：以枯草芽孢杆菌（BacilusSubtilisBF—7658） （二）培养基： 1、种子培养液

葡萄糖 1%

Tryptone(胰蛋白胨)：1%, Yeast Extract(酵母提取物)：0.5%, NaCl(氯化钠)：1% 调pH7.2

若配置固体培养基，则再加入1.5% 琼脂。 2、产淀粉酶发酵培养液

玉米粉 2 .0 % 黄豆饼粉1 .5% CaCl 2 0 .02 %

MgSO4 0 .02% NaCl 0 .25% K2HPO4 0 .2% 柠檬酸钠0 .2% 硫酸铵0 .075% Na2HPO4 0 .2 % 调节pH 值7 .0

（三）0.02M磷酸缓冲液（pH6.0） （四）实验仪器

离心机、水浴锅、250mL三角瓶、试管

二、实验

1、分别按培养基配方配制种子培养基和发酵培养基。 2、种子斜面及种子液准备

– A. 挑取单菌落从平板转接于新鲜种子斜面培养

基，37℃，24h作菌种（3支/组）。

– B. 将配好的种子培养液按每瓶50mL分装于

250mL三角瓶中灭菌（ 100KPa 20min ）。

– C. 在无菌操作条件下，将活化的菌株接种于以上培

养液中（每支斜面接两瓶），37℃ 120r／min振荡培养16h作种子液。 （6瓶/组） 3、发酵培养

– 按15-20％的接种量接种于装有50mL已灭菌菌发酵

培养基的250ml三角瓶中。37℃培养48h。

– 在无菌操作条件下，每4h取样2mL，测定酶活。

40-48h酶活降低后结束实验。

三、α淀粉酶活性测定

（1）上清酶液：发酵液0.8ml 5000rpm/5min，吸取上清0.5ml备用。

（2）吸取0.1mL标准糊精溶液，转入装有0.3mL标准碘液的瓷板空穴中，以此作为比色的标准。

（3）在比色管中加入2％可溶性淀粉液20mL，加磷酸缓冲液5mL，在60℃水浴中平衡约5min，加入0.5mL上清酶液，立即计时，并充分混匀。 （4）定时（~15s）取出0.1mL反应液于预先盛有0.3ml比色标准碘液的比色瓷板孔内，当颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准孔色相同时，即为反应终点，记录时间t

四、计算酶活

计算淀粉酶活力

酶活力(U/mL) =(60/t×20×2%×n)÷0.5

? 式中t为反应时间（分）， ? n为酶液稀释倍数， ? 0.5是使用的酶液量（mL）， ? 20是可溶性淀粉溶液体积ml 五、溶液配制

碘原液：

– 1.1克碘化钾加少量水溶解，加入碘0.55克，溶解后定容至25ml，

贮于棕色瓶中；

0.02M磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（pH6.0）

– 称取45.23g磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、8.07g柠檬酸，用水

溶解并定容至1000mL，配好后用pH计校正其pH至6.0。

比色用标准碘液：

– 取碘原液2ml，加碘化钾20g，蒸馏水定容至500ml贮于棕色瓶中；

2%可溶淀粉：

– 称取可溶淀粉2克加少量水调成糊状，在搅拌下缓缓加入约70mL

沸水中，然后用水分次冲洗残余淀粉后加入沸水，继续加热煮沸至透明（约20min），冷却后加水定容至100ml。（当天配制）。

标准糊精溶液

– 称取分析纯糊精0.06克加少量水调匀，倾入80-90ml沸水中，冷

却后加水定容到100ml

结果

α-淀粉酶产生的时间

在上述培养条件下，12小时之前蛋白酶活力较低，36小时达到高峰，继续培养至60小

时，酶活逐渐下降，结果见表1。 表α-淀粉酶活力与培养时间的关系 .

发酵时长 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 取样瓶号 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-2-1 1-1-1 1-1-2 1-1-3 1-2-1 1-2-2 1-2-3 1-3-1 1-3-2 1-3-3

α-淀粉酶的活力随细胞的生长而增强，进入对数期后，酶活显著提高。

pH 加入酶与溶液的量 发酵上清酶活测量 平均酶稀释倍反应时稀释倍反应时活 数 间 数 间 1 无终点 1 无终点 0 1 无终点 1 无终点 0 1 无终点 1 无终点 0 1 3'21'' 1 4'01'' 1.32 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 2'58'' 4'12'' 3'58'' 2'02'' 1'33 49'' 1'08'' 58'' 3'49'' 1'25'' 1'44'' 2'07'' 2'30'' 2'11'' 4'18'' 2'38'' 2'30'' 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 3'33'' 4'47'' 4'32'' 2'14'' 1'27'' 1'02'' 1'20'' 57'' 0.74 1.074 1.134 2.256 3.204 5.262 3.918 9.2 44h酶活 6.77 6.73 0.5mL酶 2mL淀粉 6.43 6.64 0.5mL酶 2mL淀6.63 粉 6.73 6.78 6.74 0.5mL酶 2mL淀粉 6.77 6.53 6.58 0.5mL酶 2mL淀6.57 粉 0.5mL酶 3mL淀6.53 粉 0.5mL酶 4mL淀6.27 粉 6.85 6.57 7.05 0.25mL酶 2mL淀6.78 粉 6.61 6.54 6.77 4'57'' 1.392 1'40'' 2'07'' 2'49'' 2'25'' 2'22'' 4'30'' 2'15'' 2'44'' 3.92 3.148 2.482 2.441 2.642 1.364 2.473 2.298

培养至36小时，随着芽抱、晶体的脱落亦即随着菌体的自溶，酶活达到高峰。

参考文献

1.唐丽江，王振华，王迪.安徽农业科学，Journal of Anhui Agri.Sci.2009,37(12):53 62-5363,5371

2. 陶文沂, 桧山圭一郎, 浜田信威, 竹西繁行, 冈田茂孝. 枯草芽孢杆菌糖化型α-淀粉酶的研究(Ⅰ)——糖化型淀粉酶的发酵生产条件及纯化[J]. 食品与生物技术学报, 1984, (02)