蛋白质含量测定

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、实验目的

1.学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2.掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4 作用下，消化生成

（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+=(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）

2.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中；

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3.滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3 三、仪器与试剂 （一）试剂

1．硫酸铜（CuSO4·5H2O） （催化剂） 2．硫酸钾 （提高沸点） 3．浓硫酸（A.R）

4．硼酸溶液（2%）：称量2g硼酸（H3BO3）粉末溶于蒸馏水100mL，（容量瓶）定容100 mL。 5．氢氧化钠溶液（30%）：30克氢氧化钠溶于蒸馏水，（容量瓶）定容100 mL。 6．0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。

7．混合指示试剂：0.1%甲基红乙醇溶液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。 0.1%的甲基红乙醇溶液：0.1g甲基红指示剂溶于100 mL 60％乙醇中； 0.1%的溴甲酚绿乙醇溶液：0.1g溴甲酚绿指示剂溶于100mL 20％ 乙醇中。 四、实验步骤

1.样品消化

称取面粉1.00g（±0.001g），用称量纸卷好小心的送入干燥消化管底部，切勿粘在瓶口或瓶颈。向另一消化管中加入1ml蒸馏水做空白试验。在每个消化管中加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，两颗玻璃珠，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将消化管分别放入消化架各个孔内，然后置于消化炉上，在通风橱中加热消化，接通电源，在加热初始阶段注意防止样品飞溅。消化炉温度起先控制在200℃左右（待内容物全部炭化，泡沫停止后），20min后可以再设定至450℃以上。消化终点是以消化液的颜色来判定的，当消化液呈浅蓝绿色的透明状时，再继续加热沸腾10min，然后结束消化过程。取下放冷，小心加20mL水（注意慢加，边加边摇），放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。 2.碱化蒸馏

蒸馏器中，碱液及蒸馏水采用电磁泵加入，NaOH、H2O注入接口用橡胶管套入后分别置入自备的容器中，加液时按面板上相应开关，液体由泵吸入消化管内。按面板上硼酸开关，量取硼酸试剂20mL于三角瓶中，加入混合指示剂2~3滴，准确吸取10.0mL样品消化液，由小漏斗流入消化管，并以10mL蒸馏水洗涤进样口流入反应室，棒状玻塞塞紧。再按面板上碱液开关，使10mL 30%氢氧化钠溶液倒入消化管，然后按面板上蒸馏开关，就开始蒸馏。从指示剂开始变色时计时，通入蒸汽蒸腾10min后，移动接收瓶，液面离开凝管下端，再蒸馏2min。然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准备滴定。

同时吸取10.0mL试剂空白消化液按上法蒸馏操作。 3.样品滴定

以0.01mol/L盐酸标准溶液滴定由绿变为淡紫色或灰色，即为终点。 五、结果计算

(V1?V2)?c?0.0140?F?100

m?10式中 X——样品蛋白质含量（g/100g）； 100X?V1——样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）；

V2——空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）； c——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；

0.0140 ——1.0mL盐酸[c(HCl)?1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g）； m——样品的质量（g）；

F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；

高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为 6.25；大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。 计算结果保留三位有效数字。

六、注意事项及说明

（1） 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。 （2） 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

（3） 硝化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。

（4） 在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

（5） 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。 （6） 加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

（7） 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。 （8） 氨是否完全蒸馏出来，可用pH试纸试馏出液是否为碱性。

（9） 吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。

（10） 以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。

（11） 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深l蓝色的结合物[Cu(NH3)4]2+

（12） 这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。