枯草芽孢杆菌α-淀粉酶的异源表达及分离纯化

以枯草芽孢杆菌(B.subtilis HN503)的基因组 DNA 为模板, 运用PCR法克隆α-淀粉酶基因,并转化大肠杆菌进行异源表达。SDS-PAGE鉴定产物及通过离子交换柱和凝胶层析分离纯化,PAGE进行纯度鉴定。

枯草芽孢杆菌α-淀粉酶在大肠杆菌中的表达及分离纯化

摘要：以枯草芽孢杆菌（B.subtilis HN503）的基因组 DNA 为模板, 运用PCR法克隆α-淀粉酶基因,并转化大肠杆菌进行异源表达。SDS-PAGE鉴定产物及通过离子交换柱和凝胶层析分离纯化，PAGE进行纯度鉴定。

1． 立项依据与研究内容

1.1 项目的立项依据

1.1.1 α-淀粉酶及其应用

α- 淀粉酶(α- 1,4- D- 葡萄糖- 葡萄糖苷水解酶) 普遍分布在动物、植物和微生物中，其国际酶学分类编号为 EC.3.2.1.1，是一种重要的淀粉水解酶。它以随机作用方式切断淀粉、糖原、寡聚或多聚糖分子内的 α-1,4 葡萄糖苷键,产生麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。它可以由微生物发酵制备，也可以从动植物中提取，而工业中主要应用的是真菌和细菌α- 淀粉酶。目前，α- 淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业，是一种重要工业用酶[1]。

α- 淀粉酶在淀粉工业中的应用。α- 淀粉酶现已广泛的应用于淀粉糖的生产, 主要 用于淀粉的糖化和液化，其水解产物如葡萄糖和果糖有着高甜度，被广泛用于饮料工业中软饮料的甜味剂。在冷饮制作中，由于淀粉糊具有老化的物理性质，低温静置会形成不溶性的硬性凝胶块，影响冷饮的质量及口感。α-淀粉酶的加入，能很快将淀粉水解到糊精和低聚糖范围大小的分子,使料液粘度急速降低，流动性增高,从而保证了高淀粉冷饮的质量,使其在口感上更适合于人们的需要。工业生产中, 淀粉的液化是将 α- 淀粉酶先混入淀粉乳中，

[2-3]加热，淀粉糊化后进行液化。

α- 淀粉酶在焙烤工业中的应用。α-淀粉酶作为一种安全、高效的改良剂,多用于面制品行业,适量的α-淀粉酶可改良面包品质,用于面包工业[4]。α- 淀粉酶用于面包加工中可以使面包体积增大, 纹理疏松; 提高面团的发酵速度;改善面包心的组织结构, 增加内部组织的柔软度; 产生良好而稳定的面包外表色泽; 提高入炉的急胀性; 抗老化, 改善面包心的弹性和口感; 延长面包心储存过程中的保鲜期[5]。

α- 淀粉酶在除垢剂中的应用。酶是现代高效除垢剂的成分之一，酶在除垢剂中最大的功能就是使除垢剂更温和无害。1975 年, α- 淀粉酶开始用于洗衣粉中。现在, 几乎 90 %以上的液体清洁剂中都含有α- 淀粉酶,而且其在洗碟机用洗涤剂中的应用需求还在不断的增加。

α- 淀粉酶造纸工业中的应用。淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层淀粉，自然界的淀粉浓度对于纸张上浆来说太高，可以利用α- 淀粉酶部分降解淀粉来调节，从而提高纸品质量、增加纸品功能、提高生产效率和降低生产成本等。

α- 淀粉酶在啤酒酿造、酒精工业的应用。耐高温α-淀粉酶是一种新型液化酶制剂,是发酵行业用量最大的酶类,其热稳定性是由蛋白质本身的热稳定性决定的,广泛应用于啤酒酿造、酒精工业中。在啤洒酿造中添加 α- 淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽, 使辅料增加, 成本降低, 特别在麦芽糖化力低, 辅助原料使用比例较大的场合, 使用 α- 淀粉酶和 β- 淀粉酶协同麦芽糖化, 可以弥补麦芽酶系不足, 增加可发酵糖含量, 提高麦汁率, 麦汁色泽降低, 过滤速度加快, 提高了浸出物得率, 同时又缩短了整体糊化时间。80 年代末, 我国无锡酶制剂厂首先生产出耐高温α- 淀粉酶, 可使副原料比例从原来的 30 %

以枯草芽孢杆菌(B.subtilis HN503)的基因组 DNA 为模板, 运用PCR法克隆α-淀粉酶基因,并转化大肠杆菌进行异源表达。SDS-PAGE鉴定产物及通过离子交换柱和凝胶层析分离纯化,PAGE进行纯度鉴定。

增加到 40 %以上, 实现了无麦芽糊化, 节粮、节能显著, 使啤酒行业的综合经济效益得到进一步提高[6]。酒精生产应用耐高温 α- 淀粉酶, 采用中温95 ℃~105 ℃蒸煮, 既可有效地杀死原料中带来的杂菌, 降低入池酸度和染菌机率, 又可保护原材料中的淀粉组织不被破坏, 形成焦糖或其它物质而损失, 从而提高原料利用率[7]。

α-淀粉酶在医药工业中的应用。为了弥补乳酸脱氢酶(LDH)、α-淀粉酶(α-Amy)、癌胚抗原(CEA)各单项检查在卵巢血清学诊断中灵敏度较低的不足,黄琛[8]将LDH、α-Amy、CEA三者进行了联合检测。经临床试验证实:三者联合检测,以其中任意两项为联检阳性,均可提高卵巢癌的阳性检出率,并有助于卵巢癌与卵巢良性肿瘤的鉴别诊断。邓淑丽等[9]研究唾液α-淀粉酶与致龋血链球菌粘附的关系,为龋病的病因学研究和预防提供了理论依据。麦角隐亭是具有药理活性的生物碱,能用于治疗高血压和处理外周血管组织障碍。用α-淀粉酶对淀粉的水解液作为碳源,发酵培养麦角菌ATCC20019,麦角隐亭产量较高。黑曲霉α-淀粉酶因具有耐酸性,适用于制造助消化的药物,开发适合于胃酸性环境(pＨ2.0左右)的耐酸性α-淀粉酶,用于制备消化助剂,将会使医疗效果更为有效[10]。

1.1.2 研究现状与立项依据

1.1.2.1 提高α-淀粉酶产量与质量的意义

各种α-淀粉酶作为一种重要的工业用酶, 已经广泛应用于淀粉及淀粉基工业中, 且已经取得了很好的使用效果。α-淀粉酶对缩短生产周期, 提高产品得率和原料的利用率, 提高产品质量和节约粮食资源, 都有着极其重要的作用。但由于不同来源α-淀粉酶的性质上的差异, 导致了其应用受到一定的局限, 如耐高温α-淀粉酶在高温条件下才能发挥最大活力, 在低温和中温时其利用效率很低, 从而限制了其应用范围。另外,不同α-淀粉酶应用于食品中, 其安全性有的尚未完全肯定。因此，提高α-淀粉酶产量及质量有着重要的经济效益和对生产发展有着重大作用。

1.1.2.2 大肠杆菌作为枯草芽孢杆菌α-淀粉酶的异源表达系统的潜力与优势

大肠杆菌是与我们日常生活关系非常密切的一类细菌，学名称作“大肠埃希菌”，属于肠道杆菌大类中的一种。它是寄生在人体大肠里对人体无害的一种单细胞生物，结构简单，繁殖迅速，培养容易，它是生物学上重要的实验材料。

大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌,它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉,可以快速大规模地生产目的蛋白等优点[11],而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统,表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的30%,因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统[12]。

1.1.3 参考文献

[1] 罗志刚, 杨景峰, 罗发兴.α- 淀粉酶的性质及应用[J].食品研究与开发，2007,28（08）：

163-166

[2] Gülay Bayramoglu, Meltem Yilmaz, M.Yakup Arica. Immobilization of a thermostable α-

amylase onto reactive membranes: kinetics characterization and application to continuous starch hydrolysis[J].Food Chemistry, 2004, 4(84): 591- 599

[3] 张力田.淀粉糖[M].北京: 轻工业出版社,1981:152- 154

[4] 张帅,刘永,黄广磊.α-淀粉酶对面包品质的改良[Ｊ].中国酿造,2008(8):42-43

[5] 孙晓云,王小生.α- 淀粉酶对面包品质的影响[J].食品工业科技,2005,11(26): 65- 67

[6] 汪建国.酶制剂在酿造行业应用的研究及其发展前景[J].中国酿造,2004, 1:1- 4

[7] 马福强. 耐高温α- 淀粉 …… 此处隐藏：4500字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……