细菌培养基的制备、灭菌及接种和培养技术

实 验 三细菌培养基的配制、灭 菌及接种和培养技术1

第一部分 细菌培养基的制备、灭菌目的要求 实验材料 实验程序

目 的 要 求熟悉玻璃器皿的洗涤和灭菌前的准备。 掌握培养基和无菌水的制备方法。 掌握高压蒸气灭菌技术。

实 验 材 料高压蒸气灭菌锅、烘箱、细菌过滤器、酒精灯。 其它：培养皿、试管、移液管、锥形瓶、烧杯、玻 璃珠等。

药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、蒸馏水等。

实 验 程 序玻璃器皿的洗涤和包装 培养基的制备 无菌稀释水的制备 培养基和玻璃器材等的灭菌

实验程序1(玻璃器皿的洗涤和包装)清洗并烘干玻璃器皿：如培养皿、移液管、试管等。 棉塞的制作 包装培养皿和移液管等。

实 验 程 序2(培养基的种类)

据组成成分可分为:1.合成培养基：由各种纯化学物质按一定比例配制而成。 2.半合成培养基：有一部分纯化学物质和另一部分天然物质配制 而成。 3.天然培养基：利用天然来源的有机物配制而成。

从培养基的物理状态可分为1.液体培养基：不加凝固剂的液体状态培养基。 2.固体培养基：在液体培养基中加入15~30g/L左右的琼脂。 3.半固体培养基：在液体培养基中加入3~5g/L左右的琼脂。

实 验 程 序2(培养基的种类) 常用凝固剂为琼脂(其次为明胶),又叫洋菜、冻粉。

实 验 程 序2(培养基的配制方法和步骤)培养基配方 牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 琼脂 蒸馏水 pH

数量

0.75g

1.5g

0.75g

3g

150mL

7.6

1. 取一个300mL烧杯，装150mL蒸馏水。 2. 按配方逐一正确称取各种成分，依次加入水中溶解。 注意： a. 前一种成分溶解之后，才能加入下一种成分 b. 可加热促进各成分溶解 c. 加热过程应不断搅拌，以免糊底烧焦，并适当 补充因蒸发而损失的水量。9

实 验 程 序2(培养基的配制方法和步骤) 3. 调pH值：用10% NaOH调pH至7.6,用精 密pH试纸对照。 4. 分装：将培养基分装于5支试管，其余全部 倒入250mL锥形瓶中，分别塞上棉塞。注意 不要污染棉塞和瓶口。 5. 包扎成捆，挂上标签，注明何种培养基。

6. 灭菌备用：培养基灭菌后必须在37℃下恒 温培养24h,确定无菌生长，方可使用。

实 验 程 序2(培养基的分装和斜面培养基的制作)☆每支试管装的量为试管高度的1/4~1/3. ☆斜面长度为试管长度的1/3~1/2.

实验程序2(培养基的配制方法和步骤)

实验程序3(无菌稀释水的制备) 取一个250mL的锥形瓶装90(或99)mL蒸馏水， 放30颗玻璃珠(用于打破活性污泥、菌块或土壤 颗粒)于锥形瓶内，塞棉塞、包扎，待灭菌。 另取5支18mm×180mm的试管，分别装9mL 蒸馏水，塞

棉塞、包扎，待灭菌。

无菌稀释水为微生物分离实验中所需要的材料。

实验程序4(培养基和玻璃器材等的灭菌)

加热灭菌有干热灭菌和湿热灭菌。 干热灭菌法：电热烘箱作为干热灭菌器 干热灭菌的操作方法 a. 将待灭菌的物品放入恒温箱，将温度调节至160℃ 并维持2h; b. 把恒温箱的调节旋钮调回零处，待温度降到50℃ 左右，才能将物品取出。

实验程序4(培养基和玻璃器材等的灭菌)

湿热灭菌：高压蒸气灭菌法 高压蒸气灭菌法的操作步骤如下： 1. 灭菌锅内加入一定量的水。 2. 将待灭菌的物品放入锅内，并关严锅盖。 注意：器物不能装得太满。 3. 接通电源，进行加热。 4. 排除高压锅内的冷空气，可将排气阀打开，待温度 计指示温度为100℃时关闭排气阀；或当排出的蒸气相 当猛烈且微带蓝色时关闭排气阀。15

实验程序4(培养基和玻璃器材等的灭菌)

5. 当压力达1.05kg/cm2(灭菌器内的温度为121℃) 即开始灭菌，使其维持15~30min。对热不稳定的培 养基如含有葡萄糖、氨基酸等物质时，应适当降低压力 (0.56kg/cm2) ,延长时间。 6. 灭菌时间一到，切断电源，待压力降至零时，才能 打开排气阀，然后打开灭菌器盖，取出物品，排出锅内 剩余水。 7. 待培养基冷却后置于37℃恒温箱内培养24h,若无 菌生长则放入冰箱或阴凉处保存备用。