小鹅瘟病毒荧光PCR检测方法的建立

试验综述

小鹅瘟病毒荧光PCR检测方法的建立

龙

朕1，林颖2，张桐源1，盛明巍1，耿庆华2，赵玉军1

（1.沈阳农业大学，辽宁沈阳110161；2.沈阳出入境检验检疫局，辽宁

中图分类号

S852.65+9.2

文献标识码

B

沈阳110016）

1672-9692(2010)05-0051-04

文章编号

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[摘要]依据GenBank小鹅瘟病毒（GPV）的NS基因保守区设计一对特异性引物，利用PCR扩增NS区片段，克隆、测序，采取Taqman探针法，构建小鹅瘟病毒的荧光PCR检测方法。结果表明，该方法检测GPV具有很高的特异性和敏感性，可以用于小鹅瘟病毒的检测。

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[关键词]小鹅瘟病毒；Taqman探针法；荧光PCR

GPV）引起的雏鹅急性或急性败血性传染病，主要引起雏鹅和雏番鸭的急性或亚急性、败血性传染病[1]。该病主要侵害4～20日龄的鹅雏，也感特别是近年来一些地区的流行，给养鹅业造成严重危害，带来重大的经济损失，因此，该病的预防控制，特别是快速而准确的诊断方法的建立受到国内外的广泛关注[5-7]。

荧光PCR是近几年来发展很快的一种检测方法，扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，实现了扩增产物检测和结果自动分析，避免了对扩增产物的后续处理，可以有效地避免实验室交叉污染，同时可在较短的时间内得到检测结果[8]。本研究采用Taqman探针法，以GPVNS基因序列为靶基因，建立了一种特异性的荧光PCR检测方法，用于对GPV的检测。通过重复性、敏感性、特异性试验，证明该方法快速、敏感、准确，从而为GPV感染的早期快速诊断提供了有力的工具。

染鸭雏，传播速度快，发病率和死亡率较高[2-4]。（GPV）的NS区基因序列，用Oligo6.0和Primer5.0

软件设计合成一对特异性引物。P1（上游引物）：5′-TCTGCTCTCAGAGAGAACG-3′，P2（下游引物）：5′-ATTACCCACTCCATCGGC-3′，P3（上游引物）：5′-AGTGATTTGGCTGCCCCTTTA-3′，P4（下游引物）：5′-TCTTTGCCGCTCTGTTGGA-3′，探针：fam-ATCCTCAAGCATCAACTGTGGCACC，引物送大连宝生物工程公司合成。1.2.2

病毒增殖和病毒DNA的提取

将两组

GPV毒株分别接种5枚9～11日龄SPF鸭胚，每胚尿囊腔接种0.2ml后，置孵化器内孵化，连续观察7d，弃去48h内死亡鸭胚。收集48～168h死亡鸭胚，取出放置4℃冰箱内冷却收缩血管。用无菌方法抽取鸭胚尿囊液，同时观察胚体病变，尿囊液作无菌检验后冻结保存备用。对照组，鸭胚尿囊腔接种无菌生理盐水0.2ml/胚。病毒DNA提取按照DNA提取试剂盒使用说明操作。

小鹅瘟病毒病料分离株均由

1.2.3

PCR反应的建立

以小鹅瘟病毒DNA为

模板，建立PCR反应。采用P1、P2建立50μl的PCR反应，反应体系为：10×buffer5μl；dNTP4μl；P1、P2各1μl；DNA1μl；ExTaq0.5μl；ddH2O37.5μl。反应条件为：95℃5min，94℃1min，56℃1min，72℃2min，30个循

1材料与方法

１．１材料1.1.11.1.2

GPV病毒试剂

本实验室保存。

pMD18-TSimpleVector、胶回收

试剂盒均购自大连宝生物公司；DH5α感受态细胞购自北京全实金有限公司；DNA提取试剂、

［收稿日期］２０１０－０２－２６

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小鹅瘟是由鹅细小病毒（GooseParvovirus，质粒提取试剂盒、高纯质粒提取试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司。

１．２方法

1.2.1引物设计根据GenBank中的小鹅瘟病毒

2010.05

试验综述

环，72℃10min。取10μlPCR产物用于1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。1.2.4

PCR结果与测序分析

PCR扩增后，取

10μlPCR产物用于琼脂糖凝胶电泳鉴定，出现一条约为2590bp的扩增条带并将阳性目的片段切胶回收与PMD18-TSimpleVector连接，转化DH5а，接种于含有AMP的LB平板，37℃过夜，挑取单菌落接种含AMP的LB培养液，37℃振荡过夜。碱裂解法小量提取质粒，采用质粒PCR的方法来鉴定是否有插入片段。将阳性菌液交由天根生化科技（北京）有限公司进行测序。测序结果在NCBI上进行比对，结果同源性达到100%。1.2.5荧光PCR扩增

采用P3、P4及探针建立

25μl荧光PCR反应，反应体系为：10×buffer1μl；dNTP1μl；P3、P4各1μl；DNA0.5μl；rTaq0.25μl；探针1μl；ddH2O18.25μl。反应条件为：95℃3min，95℃10s，57℃50s，72℃15s，40个循环，72℃10min。在每一循环退火温度结束时采集荧光信号进行荧光检测。每次试验均做阴、阳性对照。1.2.6标准阳性DNA模板的制备

将1.2.4中测

序100%正确的质粒作为阳性质粒，转化培养，大提质粒后测定浓度，算出质粒的拷贝数，用阳性质粒DNA作为标准质粒NDA模板制备标准曲线。1.2.7

动力学曲线的扩增和标准曲线的制备

将计算好拷贝数的标准DNA模板以10倍系列稀释，取9个稀释浓度（1.0×100～1.0×10-8），同一稀释梯度做重复孔对照，进行荧光PCR扩增，该方法能检测到的最低拷贝浓度为10拷贝数/PCR反应。

图2质粒PCR结果图1普通PCR结果

定性检测同一NDA进行8管的重复试验结果

CT值相同（见图3）。

２．４阳性质粒做８个稀释倍数的灵敏度试验及做

2结果与分析

２．１

ＰＣＲ扩增的电泳结果

PCR扩增产物经琼

脂糖凝胶电泳，可见大约2594bp的特异性条带（见图1），与预期片大小一致。

图3荧光PCR同一性和稳定性曲线

标准曲线有8个稀释浓度的标准NDA模板的

扩增曲线呈良好的重复性，在稀释的线性浓度范围内，随着模板量的减少，其对应的Ct值相应增大，两者之间线性相关系数达0.998（见图4和图5）。

２．２ｐＭＤ１８－Ｔ－ＧＰＶＮＳ的质粒PCR鉴定：PCR

产物切胶回收，纯化目的片段，并进行基因克隆，将构建的重组质粒pMD18-T-GOVNS做质粒PCR，1%琼脂糖凝胶电泳（见图2），从图2中可见预期大小的目的片段。

２．５特异性分析利用所建立的荧光PCR检测

方法，分别对已知的小鹅瘟病毒（GPV）、鹅副黏病毒（GPMV）、小鹅流行性感冒病毒、鹅副伤寒病原、曲霉菌等进行了检测。结果显示，只有小

２．３采取Ｔａｑｍａｎ探针法进行荧光ＰＣＲ同一性和稳

2010.05

试验综述

检测GPV的特异性引物，利用Taqman探针法，建立了用于GPV快速检测的荧光PCR方法。该方法的检测灵敏度达到最低检测达到1.0×10-8。在特异性检测中分别检测了小鹅瘟病毒（GPV）、鹅副粘病毒（GPMV）小鹅流行性感冒、鹅副伤寒、曲霉菌病，结果显示，只有小鹅瘟病毒毒株呈阳

图4荧光PCR灵敏度扩增曲线

注：从左至右模板拷贝数分别为（1.0×100～1.0×10-8）。

性反应，其他毒株均呈阴性，证明本方法具有很高的特异性。所以，利用此方法，可以对小鹅瘟进行快速检测和流行病学的调查，具有重要的临床使用意义。

[参考文献]

［１］方定一．小鹅瘟的介绍［Ｊ］．中国畜牧兽医学杂志，

１９６２，（８）：１９－２０．

［２］何长生，魏建忠．禽细小病毒分子生物学研究进

展［Ｊ］．动物医学进展，２００３，２４（３）：１２－１４．［３］李福伟，李惠敏，曹顶国，等．鹅细小病毒的分子

生物学研究概况［Ｊ］．水禽世界，２００７，１： …… 此处隐藏：4021字，全部文档内容请下载后查看。喜欢就下载吧 ……